大家好，虎年春节快乐。各位小伙伴们近期是不是在工作之余关注冬奥会和抢购冰墩墩呢？但作为一名科研狗，有时间的话还是不要忘记跟踪前言领域的学术进展情况吆！来吧，今天给大家分享的是2022年1月份发表在Nature communication（IF=14.9）上的一篇文献，文章是利用单细胞测序探究前列腺癌上皮细胞的状态，为剖析疾病发展及后续治疗提供了坚实基础。

Single-cell analysis of human primary prostate cancer reveals the heterogeneity of tumor-associated epithelial cell states

人类原发性前列腺癌的单细胞分析揭示了肿瘤相关上皮细胞状态的异质性

摘要：前列腺癌是全球男性中常见的第二大恶性肿瘤。为了描述前列腺癌肿瘤微环境特征，作者对前列腺活检样本、前列腺切除标本和局限性前列腺癌患者来源的类器官进行了单细胞RNA测序。作者发现以高雄激素信号状态为标志的前列腺上皮细胞存在异质性，且在前列腺癌中富集，并确定了一群可能与前列腺癌发生相关的肿瘤相关细胞。与ERG+细胞相比，ERG-肿瘤细胞与周围管腔上皮细胞表现出共同异质性，并可能引起常见的肿瘤微环境反应。最终，作者发现前列腺上皮类器官拥有与肿瘤相关上皮细胞状态，并富含与其亲本组织不同的细胞类型和状态。本文结果提供了诊断相关的见解，并推进了与前列腺癌发生相关的细胞状态的理解。

方法：

1.样本来源：作者获得6例前列腺癌患者活检样本，4例根治性前列腺切除术患者肿瘤样本，4例配对样本（含肿瘤组织和正常组织）；即：6例活检样本、8例根治性前列腺切除术肿瘤样本、4例正常样本。

2.单细胞RNA-seq：Seq-Well测序平台。

3.WES：3例患者的肿瘤组织和配对的正常组织进行WES测序。

结果：

1.前列腺癌（PCa）样本单细胞RNA测序概述和局限性前列腺癌主要细胞类型的鉴定

通过对样本分析获得21743个细胞，共鉴定出9种不同的主要细胞类型，通过特定的基因表达谱进行标记（图1a，b），并对每个细胞群中差异表达前10的基因进行了热图分析（图1c）。对11个患者细胞组成分析发现，每个样本中均包含了所有主要细胞类型，上皮细胞占比最高（图1d）。三类样本类型之间无显著差异（图1e）。

图1 前列腺癌样本单细胞RNA测序概述和局限性前列腺癌主要细胞类型的鉴定

2.上皮细胞簇揭示了肿瘤细胞和周围非肿瘤上皮细胞的异质性

为了确定与前列腺癌相关的上皮细胞转录状态，作者通过聚类分析确定了20个细胞簇（图2a）。表达KRT5、KRT15、KRT17和TP63的细胞簇（图2b）和显著上调基底上皮细胞（basal epithelial cells）特征评分的被鉴定为基底上皮（basal epithelial，BE）。鉴于肿瘤细胞主要表达KLK2、KLK3、ACPP和NKX3-1等LE细胞标记物，具有高LE评分的细胞既可以是肿瘤细胞，也可以是非恶性LE细胞（图2b）。BE和LE特征图还显示出另外一群细胞群（簇5），称之为其他上皮细胞（other epithelial cells，OE）（图2a，c），具有较低BE和LE评分。作者发现在四个细胞簇中，ERG+肿瘤细胞ERG表达上调（图2b）。这11个簇包括之前注释的4个ERG+肿瘤细胞簇和7个ERG不表达的簇（将其注释为ERG-negative（ERG-）肿瘤细胞）（图2c）。与非肿瘤LE细胞相比，ERG-肿瘤细胞的特征是富集了至少一个已知的前列腺癌基因集，且高表达肿瘤标志物（如SPON2和PCA3）(图2b)。

为了检验注释方法是否准确识别每种上皮细胞类型，作者计算了每种细胞类型前10的生物标志物（图2d）。BE细胞高表达基底上皮细胞标志物KRT5、KRT15、KRT17。OE群中排前10的标志物有PSCA、PIGR、MMP7、SCGB1A1和LTF，其中PSCA在前列腺癌中上调，SCGB1A1是肺细胞标志物。ERG+和ERG-肿瘤细胞和非恶性LE细胞均高表达腔内标志物KLK3、KLK2和ACPP。ERG+肿瘤细胞以表达ERG和PCA3、AMACR、TRPM8为特征，ERG-肿瘤细胞以表达PCA3和TRPM8为特征（图2d）。

先前一项正常人前列腺单细胞研究发现了两组其他的上皮细胞：以KRT13、SERPINB1、CLDN4和APOBEC2表达为特征的“丘细胞”（hillock cells）和以SCGB3A1、PIGR、MMP7、CP和LCN2表达为特征的“棒状细胞”（club cells）。在本研究中虽未发现第一群细胞（hillock cells），但确实发现了一个独特的群体，它与第二群细胞类似，占所有上皮细胞的6.5%，它表达PIGR、MMP7、CP和LTF（图2d）。作者就假设这个上皮细胞簇代表了以前在肺和正常前列腺标本中描述过的club细胞。为了验证这一假设，作者将一个正常的前列腺club细胞基因集投射到上皮细胞，发现club细胞评分高的细胞很大程度上与OE簇重叠（簇5）（图2e）。此外，与其他细胞簇相比，该簇含丰富的club特征（图2f）。

图2 肿瘤细胞和主要上皮细胞类型鉴定

3.Club细胞和BE细胞有前列腺癌富集的LE样细胞状态且AR信号中上调

Club细胞在前列腺癌分析中尚未被确定。由于作者在前列腺癌样本中只捕获了club细胞，而没有捕获“丘细胞”细胞，假设club细胞可能与癌变有关，在某些细胞状态下，前列腺癌club细胞可能被富集。为了验证这一假设，作者将前列腺癌club细胞与之前健康对照研究中正常club细胞结合，检测到6种具有不同转录组谱的细胞状态（图3a）。与正常样本club细胞相比，前列腺癌club细胞表现出LCN2和SCGB3A1基因下调，以及LTF、AR和AR下游成员包括KLK3、KLK2、ACPP和NKX3-1上调（图3b）。

对于这六个亚群来说，均存在不同的差异表达基因（图3c），细胞簇0中前列腺癌club细胞中占45%以上，且前列腺癌Club细胞占比是正常club细胞的3倍以上（图3d）。该簇特点是LTF、腔内标记物和AR通路下游基因KLK2、KLK3、ACPP、PLA2G2A和NKX3-1表达较高（图3e），表明其处于腔样和雄激素应答状态。

细胞簇0中明显上调的基因集是雄激素反应通路（图3f）。接下来，作者测试这种前列腺癌富含的细胞状态是否代表腔样细胞状态。作者发现与其他细胞状态相比，细胞簇0的LE评分很高（图3g）。作者比较了细胞簇0、其他聚类细胞和前列腺癌样本中的LE和club细胞标记物表达水平，发现club细胞簇0比其他细胞状态表现出LE标记物KLK2、KLK3、ACPP和NKX3-1的表达更高的情况（图3h），且club标记物PIGR、MMP7、CP和LTF在所有club细胞中的表达显著高于LE群体（图3h）。总之，与正常前列腺club相比，前列腺癌club细胞具有更高的雄激素信号，并富集LTF^high和NKX3-1^high腔样细胞状态（图3i）。

图3 鉴定具有上调雄激素反应特征的前列腺癌富含的club细胞状态

4.BE和LE细胞的整合鉴定了前列腺癌样本中富含的肿瘤相关细胞状态

腔内样club细胞状态的发现引导作者研究前列腺癌样本BE细胞群中是否存在类似细胞状态。因此，作者将前列腺癌样本BE细胞（BE PCa）与正常样本BE细胞（BE normal）进行整合，确定了9个细胞簇（图4a），而所有9个细胞簇在BE PCa和BE Normal细胞中都有，细胞簇6在PCa样本中显著富集，而细胞簇4在正常样本中富集（图4b）。雄激素反应通路、雌激素通路、胰岛素信号通路和C2CP相关的癌症KEGG通路显著上调（图4d）。AR通路成员是细胞簇6的主要标志物（图4e）。虽然在上皮细胞中BE簇6并没有与其他BE细胞聚集，但作者推测BE细胞簇6可能代表了BE/LE细胞的中间状态（图4f）。BE细胞簇6中唯一显著不同是腔内标记物高表达（图4g），尽管与前列腺癌LE细胞相比，表达水平较低。此外，作者发现BE细胞簇6在雄激素反应和LE评分中显著上调（图4h），表明这种细胞状态可能是一种与前列腺癌相关的腔样状态。

图4 BE和LE细胞整合鉴定了前列腺癌样本中富含的肿瘤相关细胞状态

5.整合上皮细胞分析揭示前列腺癌样本中AR信号上调

为了描述前列腺样本中全部上皮细胞转录组特征，作者整合了所有前列腺上皮细胞和先前正常健康对照的前列腺上皮细胞（图5a）。作者在所有三种主要类型的上皮细胞（LE、BE和club细胞）中鉴定了肿瘤和正常样本之间的差异表达基因，发现FOS、JUN和PSAP是所有细胞中普遍上调的基因（图5b）。在BE和club细胞中两个前列腺癌富集的细胞与其他BE和club细胞相比，AR通路明显上调。作者测试综合数据集中AR表达，发现在前列腺癌上皮细胞中，21.4% BE、28.6%的club、52.7%的LE、43.2%肿瘤细胞为AR+，与正常样本中相同类型的细胞相比显著升高（图5c）。作者还计算了所有细胞的雄激素反应通路评分，发现与正常样本相比，前列腺癌样本中三种主要上皮细胞类型AR信号上调（图5c）。BE的AR得分仅与BE细胞簇6呈显著正相关，club细胞AR打分与club细胞簇0呈显著正相关（图5d）。在RNA-seq数据集中，AR打分与BE细胞簇6和club细胞簇0呈正相关（图5e），这也使作者确定了BE细胞和club细胞状态，且它们雄激素反应和前列腺癌关系更密切。

图5 前列腺癌和正常上皮细胞的整合揭示了由前列腺癌富集的BE和club细胞状态驱动AR信号上调

6.ERG+肿瘤细胞转录组图谱具有患者特异性，而ERG-肿瘤细胞与周围LE细胞重叠

在所有上皮细胞聚类分析中，ERG+肿瘤细胞与非恶性LE细胞是独立的，而ERG-肿瘤细胞与非恶性LE细胞更接近（图2c）。作者首先分别分析了ERG+和ERG-肿瘤细胞的亚结构确定了不同细胞状态（图6a，b）。ERG+肿瘤细胞呈现患者特异性，而在ERG-肿瘤细胞中没有这种模式，因为大多数ERG-肿瘤细胞不仅在一个患者中存在（图6c）。作者观察到ERG+肿瘤细胞与非恶性LE细胞有明显不同，而ERG-肿瘤细胞与非恶性LE细胞没有明显区别（图6d）。ERG-肿瘤细胞没有观察到患者特异性（图6e）。在两组数据集中，TMPRSS2-ERG融合状态与ERG+肿瘤细胞评分显著正相关，TMPRSS2-ERG融合缺失与ERG-肿瘤评分显著负相关（图6f）。这些结果支持肿瘤细胞的特征和使用ERG表达作为分类注释肿瘤细胞。BE、LE和club细胞GSEA分析存在不同（图6g）。

图6 ERG+和ERG-肿瘤细胞的比较揭示了患者特异性细胞状态和患者之间异质性

7.T细胞和基质细胞分析揭示了ERG-患者的共同信号转导

ERG+和ERG-肿瘤细胞转录组差异表明，它们可能在肿瘤微环境中引起不同的反应。为了确定肿瘤相关免疫细胞，以及特定免疫细胞是否在ERG+或ERG-样本中存在差异，作者分析了T细胞群，并根据差异表达基因确定了CD4和CD8 T细胞、Treg和NK细胞（图7a）。然后，作者根据ERG状态对T细胞进行分群，发现了两个CD4 T细胞群。在发现的两个CD4 T细胞集群中，CD4 T细胞群1在ERG+患者中富集（图7b），并以高表达FOSB、FOS和JUN为特征。CD4 T细胞群2在ERG-患者中富集（图7b），并以高表达CXCR6和DUSP4为标志（图7b）。同样，作者根据患者ERG状态对基质细胞进行分群，并确定了包括内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞（图7c）。在这三种基质细胞中，成纤维细胞在ERG+患者中富集（图7d）。为了检测ERG-和ERG+患者肿瘤细胞之间的差异可能驱动不同基质细胞群和免疫反应，作者在ERG-和ERG+肿瘤细胞、CD4 T细胞和基质细胞之间进行了GSEA分析，并计算了ERG-患者中显著上调基因集的交集。在ERG-肿瘤细胞、CD4 T细胞和基质细胞中发现了14个上调基因集（图7e）。对于club细胞，在ERG-患者中没有发现显著上调或下调的通路（图7f）。ERG-患者中常见的14个上调基因集包括PD-1反应组和IFN-γ信号反应组（图7g），据报道这两种基因在晚期前列腺癌中均上调。CD4 T细胞、肿瘤细胞和基质细胞中HLA基因家族的表达明显高于ERG+细胞群（图7g）。

图7 CD4 T细胞群与ERG状态和ERG-肿瘤微环境中PD-1和IFN-γ信号通路上调有关

8.前列腺癌类器官中含有上皮细胞，在BE细胞和club细胞中具有独特的扩张细胞状态

为了建立模型来确定单细胞分析揭示的细胞状态异质性，并确定是否可以重建和繁殖前列腺癌相关club细胞，作者使用已建立的方法从6名接受局限性前列腺切除术的患者单细胞中获得局限性前列腺癌类器官，并在三次传代内使用scRNA-seq对其进行表征分析。基于从前列腺组织样本和正常样本中生成的细胞类型，共确定了6种上皮细胞（图8a）。为了证实在类器官中恢复了细胞类型多样性，对KRT8+腔细胞和KRT5+基底细胞进行了免疫荧光染色（图8b），通过对SCGB1A1和LTF染色验证club细胞体外增殖能力，该蛋白在scRNA-seq鉴定的前列腺癌club细胞中上调（图8b）。为了测试类器官可以作为肿瘤组织模型的保真度，作者将早期传代（P0-P3）类器官样本中的细胞与来自类器官的4个根治性前列腺切除术样本上皮细胞整合在一起（图8c）。对于4种来自患者的类器官，与亲本组织相比，只有少量肿瘤细胞被捕获。然而“丘细胞”、MSCs和MKI67+上皮细胞只存在于类器官样本中，在前列腺癌组织样本中未观察到（图8d）。BE标记物KRT5、DST和KRT15在来自组织和类器官的BE群体中表达，而club细胞基因MMP7、LCN2和CP在两个club细胞群体中均表达（图8e），表明组织和类器官BE和club细胞之间存在相似性。类似地，当用前列腺癌组织中club细胞分析类器官club细胞时，作者发现共有8个独特细胞簇，并在类器官样本中观察到细胞状态扩展（图8f）。相反，细胞簇7包括了ACPP、NKX3-1、KLK2和KLK3等LE标记，这与之前发现的前列腺癌富集的club细胞状态特征相一致（图8g）。

图8 体外类器官样本含有丰富的前列腺癌BE和club细胞状态

结论：

总之，本文提供了局限性前列腺癌的单细胞转录组图谱，以确定和突出与前列腺癌发生相关的多细胞环境和细胞状态。研究结果为前列腺癌相关的上皮微环境和细胞状态变化提供了见解，从而改善了前列腺癌的诊断。

参考文献：

Song H, Weinstein H N W, Allegakoen P, et al. Single-cell analysis of human primary prostate cancer reveals the heterogeneity of tumor-associated epithelial cell states[J]. Nat Commun. 2022,13(1):141.