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给大家带来一篇发表在《Cancers》(if:6.86)上的文章，肿瘤分子亚型的建立促进了研究人员对肿瘤基因型和表型的认识，在治疗和预后评估方面具有潜在的应用价值。这篇干湿结合的文章，利用共识分子聚类方法将肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）划分为6个分子亚型，系统揭示了6个分子亚型的特异性分化模式、突变基因、组织学和总体生存率。接下来小编带大家一起阅读一下这篇文章。
肌肉浸润性膀胱癌(MIBC)是一种具有相当异质性的恶性肿瘤。MIBC肿瘤微环境(TME)是高度复杂的，包括不同的表型和空间结构。必须对MIBC TME的复杂性进行描述，以提供精确治疗的潜在靶点。本研究采用大细胞计数和成像大细胞计数相结合的方法，对44例MIBC患者的肿瘤细胞、免疫细胞和TME空间特征进行分析。研究人员检测到异常表型的肿瘤和免疫细胞簇。特别是发现了一个以前被忽视的癌症干细胞样细胞集群(ALDH + PD-L1 + ER -β恖)是与不良预后密切相关。研究人员阐明了在MIBC TME中免疫细胞(排除、浸润和废弃)和肿瘤相关胶原(弯曲、拉伸、方向分布和混乱)的不同空间结构。
目前这个研究是第一个在单细胞水平上深入了解MIBC TME复杂性的研究。研究人员的结果将提高对MIBC异质性特征的普遍理解，潜在地促进患者分层和个性化治疗。
为了绘制MIBC的TME图，使用CyTOF(质谱流式细胞仪)评估44例患者的79个样本(图S1)，包括44个癌(CA)组织和35个癌旁(CP)组织。采用t-SNE算法对高维数据进行降维，。对MIBC TME中单个细胞的分析显示了各种独特的蛋白表达模式(图1A)。为了检测TME中的特定聚类，使用表型算法识别了21个表型不同的聚类(图1B)。CA和CP组织的聚类分析显示，CA和CP组织中许多聚类的频率不同，说明CA和CP组织中TME的构成不同(图1C)。研究人员检测到7个特异性的CD326和CD45阳性表达，同时具有免疫细胞和肿瘤上皮细胞的特征。这21个特定的聚类显示出个体样本之间的高度异质性(图1E)。在MIBC TME中，肿瘤细胞簇表现出不同的蛋白表达模式(图1D)。
为了进一步探索特定群集的特征，研究人员根据每个群集的频率将患者分层，分为高丰度组和低丰度组。值得注意的是，SPADE分析显示，与低丰度组患者相比，聚10高丰度组患者肿瘤上皮细胞高表达c-Myc、Ki67、vimentin，提示高丰度组患者可能呈现上皮-间充质过渡(epithelial-mesenchymal transition, EMT)状态和高增殖率。集群18显示出与集群10相同的模式(图2A,B)。
为揭示MIBC生态系统聚类间的关系，采用spearman秩相关分析。显示了MIBC TME中集群之间的许多关系(图2C)。肿瘤干细胞样细胞簇3、CD326+CD45+肿瘤上皮细胞簇10和18之间存在较强的相关性(图2D)，表明这些簇在TME中可能发挥着相似的作用，而肿瘤细胞簇与免疫细胞簇之间存在多种强相关性(图2C)。上述结果表明，集群间的相互作用导致了MIBC TME的复杂性。
研究人员发现了一种以前未被欣赏的癌症干细胞样细胞集群ALDH + PD-L1 + ER -β恖集群(6)是与不良临床结果(图1 d和图3)。根据聚类6的频率将患者分为高丰度组和低丰度组，研究人员发现聚类6高丰度组患者与晚期和年龄相关(图3B,C)。同时，聚6高丰度组63.6%的患者出现肿瘤脱分化，上皮细胞标志物Pan-CK和E-cadherin表达缺失，而低丰度组只有27.8%的患者出现脱分化状态(图3F,G)。此外，IMC的空间分析显示，聚类6位于肿瘤侵袭前方的间质区域(图3D,E)，代表了肿瘤出芽细胞的表型。
为了进一步了解聚类6中高丰度组和低丰度组患者的分子特征，研究人员分析了这两组患者之间的差异基因，发现许多差异基因在神经元胞体中富集，对神经发生、神经递质转运、神经迁移等具有正调控作用。和其他神经相关通路(图3H)。在TCGA膀胱尿路上皮癌(BLCA)队列中，高水平的B4GALNT1与临床分期和不良预后显著相关(图4B,C)。在队列研究中，与B4GALNT1表达显著相关的基因在神经递质运输、神经元分化正调控和许多其他神经相关通路中富集。免疫组化(IHC)染色和苏木精-伊红(HE)染色结果显示，B4GALNT1也位于间质区，提示B4GALNT1与簇6关系密切。
DEGs富集分析显示，B4GALNT1高表达组和低表达组成纤维细胞间主要上调的DEGs显著富集于细胞外间隙、细胞外区域、ECM和细胞外泌体(图4D)。此外，通过GO分析高表达组和低表达组肿瘤上皮细胞中上调的deg，发现细胞外泌体是排在前列的信号通路;细胞外间隙和ECM在前20个信号通路中(图4E)。高表达组成纤维细胞中HSPH1、HSPD1、HSPA6、HSPA1B、HSPA1A、HSP90AA1等热休克蛋白表达上调(图4F)。相关性分析表明,集群的时差B4GALNT1高表达患者显著高于低表达患者(图4 g H)和集群的空间分布B4GALNT1高表达患者比低表达患者更混乱,提示B4GALNT1高表达患者的TME中出现更多的细胞-细胞串扰(图4I,J)。综上所述，所有这些数据可能表明B4GALNT1通过激活细胞外泌体促进细胞簇间的串扰，从而促进MIBC进展。
近年来，免疫治疗是肿瘤治疗的革命，它受肿瘤免疫微环境的影响。为了绘制MIBC的免疫微环境图，研究人员设计了一个包含34种抗体的面板来分析MIBC生态系统中免疫细胞的蛋白表达模式。为了获得免疫细胞的蛋白表达，研究人员在细胞库平台上用免疫细胞特异性标记物CD45对免疫细胞进行门控。然后,通过t-SNE和phenograph算法被用来处理高维数据和识别19免疫细胞集群MIBC生态系统中不同的表型(图5),包括6个CD4 + T细胞集群,5 CD8 + T细胞集群、2 B细胞集群,3 DC细胞集群,2巨噬细胞集群,集群NK细胞(图5)。CA组织和CP组织中群集的频率差异较大，说明CA组织和CP组织的免疫微环境是不同的(图5A,B)。
研究人员进一步分析了单个肿瘤样本中聚集的频率，发现每个样本中都存在一个数量上具有绝对优势的独特的免疫细胞簇，表明单个样本中的免疫细胞是异质性的(图5D)。T细胞在免疫微环境中具有抗癌和促癌双重作用。在MIBC生态系统中，11个免疫检查点、共抑制受体和激活标记物表达模式不同的T细胞簇，如图5C所示，代表耗尽或免疫抑制表型。
1.聚类16表现为高水平的PD-1 (CD279)、TIM-3、GranzymeB、CD27, CD95、HLA-DR、CTLA-4、ICOS (CD278)阳性表达，为耗尽的CD8+ T细胞簇。
2.聚类10、12和13的PD-1、CTLA-4和HLA-DR表达呈阴性，而聚类17的标记物表达模式与聚类16相同，但PD-1、ICOS、CTLA-4、HLA-DR和CD95表达水平较低。
3.聚类19高表达CD3、CD4和Foxp3，为Treg细胞簇，阳性表达PD-1、TIM-3、HLA-DR，高表达CTLA-4、CD28、CD27、ICOS。
聚类11、14、15和18的标记表达模式与聚类19相似，但表达水平较低(图5C,E)。
分析不同聚类结果后，研究人员发现当将病人分成高low-abundance组,根据每个集群的频率,浸润T细胞的频率,包括CD4 + T细胞、CD8 + T细胞亚群和PD-1 + T细胞在集群16丰富的集团,都显著高于low-abundance组(图5)。同时，聚16高丰度组PD-1+、TIM-3+和CTLA-4+免疫细胞的频率也显著高于低丰度组(图5G)。簇16高丰度组的CD8+ T细胞、Tregs和巨噬细胞的免疫检查点、共抑制受体和激活标志物表达水平显著高于低丰度组。集群19的模式与集群16相似(图5F,G)。这提示群集16和群集19可能与MIBC的免疫抑制微环境有关。
最近，一项共识分子分类(ConMC)总结了已发表的分类和6个亚型的聚合MIBC的优点，该分类基于来自18个已发表的数据集的1750个MIBC转录组谱。ConMC为MIBC研究提供了一个新的框架。在本研究中，研究人员根据ConMC将38个样本分为6个分子亚型，并在单细胞水平上分析6个分子亚型之间的TME特征。而6个分子亚型的TME组分无显著差异，说明MIBC TME具有较大的异质性，ConMC并没有为MIBC TME研究奠定基础。
成像质量血细胞计数： 接下来，为了进一步分析MIBC TME的复杂性，研究人员进行了成像质量血细胞计数(IMC)，以探索基于空间分辨率的MIBC TME表型。观察Pan-CK(上皮细胞)、I型胶原(细胞外基质)和CD45(免疫细胞)，以鉴定MIBC TME的形态学特征。在TME中，研究人员观察了肿瘤细胞、免疫细胞和胶原蛋白信号的几种主要空间表型。在肿瘤区域，出现两种类型的tme;I型区域上皮细胞标志物Pan-CK和E-cadherin表达强烈(图6A)。同时II型区域PanCK和E-cadherin表达缺失，提示肿瘤发生脱分化(图6B)。它常发生在预后差的样本中。
免疫细胞： 免疫细胞在MIBC TME中也表现出三种主要的空间分布模式。在I型区域富集的免疫细胞被肿瘤细胞排除，肿瘤细胞不浸润肿瘤巢(图6C)。II型区域招募了浸润肿瘤巢的免疫细胞(图6D)。III型区域免疫细胞较少(图6E)。
胶原蛋白标记空间分布： 同样，在MIBC TME中出现了四种主要的胶原蛋白标记空间分布模式。I型区包裹肿瘤巢的弯曲胶原纤维富集(图6F)。II型区丰富的胶原纤维伸展并更平行于肿瘤边界排列(图6G)。III型区域含有定向分布的胶原纤维(图6H)。IV型区域胶原纤维排列混乱，肿瘤边界不清晰(图6I)。这些结果表明，MIBC TME是高度复杂的；这就是为什么MIBC患者的治疗反应非常不同。
在个性化精准医疗时代，根据分子特征对患者进行亚分组正成为决定癌症预后和治疗的关键因素。在本研究中，研究人员使用了CyTOF和IMC来研究MIBC TME的复杂性，揭示了TME的异质性特征，比之前相关研究所了解的更为复杂。研究人员揭示了MIBC的肿瘤细胞和免疫细胞的不同表型，并确定了与不良预后相关的特定肿瘤干细胞样细胞簇。此外，本研究还分析了基于空间分辨率的免疫细胞表型和胶原蛋白特征。综上所述，这个研究为今后的MIBC TME研究提供了资源，并可能为MIBC的精确治疗提供方法。
