Defining HPV-specific B cell responses in

patients with head and neck cancer

头颈癌患者中鉴定出HPV-特异性B细胞反应

2020年11月发表在Nature（IF: 49.962）上的文章。本研究从43名患者身上切除的头颈部肿瘤样本，在HPV阳性的头颈癌患者的样本中检测到HPV特异性B细胞反应，并且原位检测到HPV特异性IgG抗体，同时观察到类似于生发中心的结构，这些结构类似于淋巴结中的用于在免疫反应期间对B细胞进行“训练”的生发中心。

摘要:

肿瘤通常含有B细胞和浆细胞，但这些瘤内B细胞的抗原特异性尚不清楚。在HPV阳性的头颈部癌症患者的样本中检测到特异性B细胞反应，其活跃地产生hpv特异性IgG原位抗体。在肿瘤微环境中存在hpv特异性抗体分泌细胞(antibody secreting cells-ASCs)，感染的细胞很少会出现该旁观者招募的现象，暗示HPV感染导致B细胞存在局部和抗原特异性的ASC反应。人乳头瘤病毒特异性ASC反应与血浆IgG滴度相关，直接针对人乳头瘤病毒E2、E6和E7蛋白，其中对E2的反应最为显著。利用瘤内B细胞和浆细胞，我们生成了几种hpv特异性的人单克隆抗体，这些抗体表现出高度的体细胞高突变，与慢性抗原暴露一致。单细胞RNA测序分析检测到肿瘤微环境中激活的B细胞、生发中心B细胞和ASCs。与肿瘤实质相比，B细胞和ASCs优先定位于肿瘤间质，并有形成良好的激活簇。

B细胞表明正在进行的生发中枢反应。总的来说，我们发现在肿瘤微环境中可以发现抗原特异性激活和生发中心B细胞以及浆细胞。该发现能够帮助人们更好理解人类癌症中体液免疫反应，并暗示肿瘤浸润的B细胞可以用于开发治疗药物。

肿瘤微环境(TME)中存在hpv特异性抗体分泌细胞

我们获得了手术切除的表达p16的头颈部鳞状细胞癌样本，p16是一种广泛使用的HPV状态的替代标记物，特别是在口咽鳞癌中。我们使用基因组来确认HPV状态，在43例颈部鳞状细胞癌患者中选取32例p16+患者，并从福尔马林固定石蜡包埋切片中分离DNA。32份样本中有31份检测出HPV DNA，大多数病例(84.4%)检测出HPV type 16阳性。接着对来自浸润在原发肿瘤的淋巴细胞(TILs)和来自p16+头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)患者内的转移性淋巴结(metLNs)和外周血单个核细胞(PBMCs)进行抗体分泌细胞(ASCs)量化。与外周学血相比，metLNs和TILs显示ASCs明显富集。metLNs和TILs中的ASCs主要产生IgG，其次是IgA和IgM, 分泌IgG+的ASCs占淋巴细胞总数的0.11% ~ 3.8%。相比之下，p16+ HNSCC患者外周血中的ASCs的频率较低，表现出不同的同型分布(IgA≥IgG>IgM)，在频率和同型分布上 与健康个体外周血ASCs相当。

接下来试图寻找TME中的ASCs是否产生针对HPV抗原产生特异性抗体。

进一步检测发现，metLNs(转移性肿瘤淋巴结)和TILs(肿瘤浸润淋巴细胞)中IgG+ ASCs能够产生HPV蛋白E2、E6、E7的特异性抗体，且E2特异性抗体反应占据大部分(图1,a-c)

图 1 HPV阳性HNSCC患者TME中存在HPV特异性抗体分泌细胞

a表示酶联免疫吸附点(ELISPOT)显示TILs中分泌E2、E6和E7特异性IgG+的ASCs。b, c,表示分泌E2、E6、E7特异性IgG+的ASCs,metLNs (n = 38) (b)和TILs (n = 23) (c)。红色点表示无任何反应的患者。

与之前的报道一致，与p16+肿瘤相比，p16- HNSCC肿瘤lym细胞浸润明显减少，ASCs总量差不多，但缺乏hpv特异性IgG+ ASCs。p16- HNSCC患者相对于p16+ HNSCC患者缺少HPV特异的IgG+记忆B细胞。(图1d)

接下来，我们比较了14例p16+患者TME中流感和HPV特异性ASCs 的数量，在TME中的 ASCs简单地反映了炎症驱动的循环招募和分化。虽然流感特异性MBCs在外周血中明显较高，但HPV特异性ASCs在TME中占主导地位 (图1d )。这些数据表明，表明HPV特异性IgG抗体在TME中是积极产生的，E2蛋白是体液免疫反应的主要靶点。

ASC与HPV抗体的相关性

肿瘤微环境（TME）存在hpv特异性IgG+中的ASCs促使我们在队列中调查HPV E2、E6和E7的血清学反应。血浆中抗E2、E6、E7的IgG抗体滴度可以明确区分p16+患者HNSCC(n = 39)从p16- HNSCC(n = 10)（图2a）。在一组患者中，对HPV E抗原的血浆IgG反应主要由IgG1组成，其次是高度不同水平的IgG3(图2b)。值得注意的是，HPV特异性IgG滴度与在metLNs和TILs中的ASCs的IgG滴度相关（图2c）。

图 2

生成HPV特异性人类抗体

之前已经发现了抗原特异性B细胞的一个子集，称为“激活B细胞”(ABCs)，这是一种增殖细胞，与ASCs不同，属于MBC谱系，在接种或感染后存在于外周血。接下来想要探究TME中是否存在hpv特异性的abc，是否可以用于产生hpv特异性的人类单克隆抗体。我们使用荧光激活细胞分选(FACS)和荧光标记的E2蛋白纯化hpv特异性ABCs(CD19+

IgD−CD20+CD71+)（图3a）。14个成功产生的抗体中有12个(约86%)被识别E2在酶联免疫吸附试验(ELISA)中的应用（图3b）。E2特异性单克隆抗体在重(Vh)链和轻(Vl)链的可变区表现出高度的体细胞高突变(SHM)，三个克隆谱系分别由两个克隆表示(图3c)。此外，在hpv特异性抗体中“激活B细胞”(ABCs)和高度SHM的存在表明这些肿瘤相关病毒抗原与长期和持续的体液免疫反应相关。

图 3（点的颜色表示对应的抗体）

肿瘤微环境(TME)中B细胞的scRNA-seq分析

从三个HPV+HNSCC患者的metLNs和TILs中获得B细胞系活化细胞(CD19 +IgD−CD71 +)，并用无监督方法进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析（图4a）。此外，我们从接种季节性流感病毒疫苗7天后的健康参与者外周血中分离出活化的细胞。总共有8271个单细胞鉴定出4个簇(图4b,c)。在基因表达谱和基因集富集分析的基础上，我们将细胞簇命名为ABCs、ASCs、生发中心B细胞(GCBs)和过渡细胞(transitory cells)，这些细胞簇表现出ASCs、GCBs和增殖基因集富集的杂交表型。总的来说，在所有的细胞簇中都发现了来自metLNs和TILs的激活细胞，尽管患者之间的分布差异很大（图4d）。相比之下，在季节性流感疫苗接种7天后，从PBMCs中提取的激活细胞在GCB集群中未被检测到，在临时细胞集群中几乎不存在。

图 4

B细胞亚群的转录组

接着，我们进行了RNA-seq分析，以确定三种主要B细胞亚群之间的转录差异(ASCs，ABCs和GCBs)。我们用流式细胞

从两个HPV+ HNSCC患者的metLNs和TILs进行纯化（图5a），ASCs (CD19+ CD20− IgD− CD38^hiCD71+ ), ABCs (CD19+ CD20+ IgD− CD71+ CD10− )，GCBs (CD10+ ABCs)。此外，我们分析了在接种季节性流感疫苗后第7天从健康受试者外周血中分离的ASCs和ABC。为了更广泛地描述转录景观，我们首先进行了主成分分析，确定了两个主成分(PC)，它们共同解释了大约60%的观测到的转录变异（图5b）。PC1占转录变异的41%，能清晰区分ASCs、ABC和GCB，还能从血液ABC中分离出组织。通过k-means聚类对单个基因进行基因表达分析，确定了6个基因簇，根据分类的子集以及样本来源(血液和组织)来区分样本(图5c)。ASC的特征是表达增加常见的ASC相关基因如XBP1、MZB1、CD27和CD38的，而B细胞谱系是表达降低的基因如MS4A1、IRF8和CD24的。肿瘤来源的ASCs显示额外的浆细胞相关基因如PRDM1, SDC1的表达增加。与这些数据一致，大部分ASCs在TME(n = 14)不表达Ki67，这表明肿瘤相关ASCs更像浆细胞表型。GCB表达高水平的BCL6, AICDA, MME和S1PR2。值得注意的是，来自外周血的流感特异性细胞不同于肿瘤来源的细胞，它们高表达参与细胞迁移的基因，如CD52、S1PR4和ITGA3。

图 5

B细胞瘤内定位

接着，我们开始研究B细胞和ASCs在7例HPV +头颈部鳞状细胞癌定位（图5d）。总B细胞(CD19+CD20 +)和ASCs (CD19+

CD20−IRF4 +)在基质中比p16+肿瘤更为普遍（图5e）。激活B细胞(CD19+CD20+Ki67+)倾向于在间质中以更高的密度存在，在肿瘤间质中有形成良好的ABC簇，表明生发中心反应(图5e)。TME中ASCs主要为Ki67−但CD138的表达差异很大，提示浆细胞分化的不同阶段。

总的来说，我们的数据显示，在TME中存在几种不同的抗原特异性B细胞亚群，包括ABC、GCBs、最近生成的浆细胞和处于不同分化阶段的浆细胞。

方法

样品的采集、制备和储存

接受手术的HNSCC患者是根据经批准的Emory大学机构审查委员会协议(WINSHIP4008-17)招募，所有患者都提供知情同 意。所有患者在手术时都曾有未经治疗的局部晚期疾病，表 现为局部转移性淋巴。组织样品被切成小块，分离淋巴细胞。 在手术时在柠檬酸钠CPT细胞制备管(BD)中采集外周血样本，并立即处理以获得PBMCs和血浆。对照样本来自健康的个人。

流式细胞

用流式细胞仪进行细胞分选。

抗原

重组HPV抗原与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合在大肠杆菌中表达。

编码 HPV16E2(UniprotP03120) ，HPV16E6(UniprotP03126)和HPV16E7的DNA序列 从合成的 E2-E6-E7基因结构 (Genscript)中扩增Uniprot P03129。采用2018-2019年或2019-2020年季节的四价灭活季节性流感疫苗Fluarix(GSK)来评估流感特异性反应。

ELISA和ELISPOT

ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。

ELISPOT是用于在单细胞水平检测细胞因子(CK)分泌细胞和抗体分泌细胞(ASC)的一项细胞免疫学检测技术。通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下或通过仪器对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（详细流程请参考原文）

免疫印迹

通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。（详细流程请参考原文）

HPV分型

用BLAST对PCR产物进行纯化、测序和分析。（详细流程请参考原文）

抗体制备

asc (CD3/14/16−CD19 +CD20−IgD−CD38^hiCD71 +)或E2特异性激活的B细胞(CD3/14/16−CD19+CD20+IgD−CD71+MBP-E2 +)的单细胞分选到96孔板含有细胞裂解缓冲液。如前所述进行IgG重链和轻链基因的克隆，并进行少量修饰。

通过IgBLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)分析V(D)J的使用情况和对克隆的单克隆抗体进行SHM序列分析。

多重免疫组化和图像分析

采用OPAL Polaris系统(Akoya Biosciences)进行七色多重免疫组化。使用Vectra Polaris多光谱成像系统对染色玻片进行成像和扫描。高分辨率全片扫描图像的随机肿瘤区域(包括肿瘤实质和基质)首先在PhenoChart 1.0.12 (Akoya Biosciences)中注释，然后使用inForm2.4.8软件(Akoya Biosciences)进行分析。使用DAPI和P16作为肿瘤的标记物来识别肿瘤实质和间质区域。对于HPV阴性肿瘤，CD138被用作肿瘤的替代标记物。基于核DAPI和膜质CD20完成自适应细胞分割。从感兴趣的免疫细胞表型中，至少有25个细胞被手工选择，并用于训练软件进行自动分析。数据R包phenoptr (v.0.2.5) 和phenoptrReports (v.0.2.6)进行处理(Akoya Biosciences)。

scRNA-seq分析

使用Cell Ranger v3.1进行比对、过滤、条形码计数和唯一分子标识符计数。使用Seurat v.3.1.4对数据进行更深一步的分析。所有单细胞分析使用R .3.6.2进行。简言之，包括线粒体基因百分比低于0.07%的细胞。检测到的基因超过6000个或少于1000个的细胞被认为是异常细胞，并被排除在下游分析之外。使用Seurat函数“FindIntegration Markers”将来自不同患者的样本合并，该函数识别并计算数据集对之间的锚，以减少样本批处理效果。由于免疫球蛋白基因转录本构成ASC/GC簇的转录组的大部分，因此除另有说明外，免疫球蛋白基因被排除在分析之外。原始唯一分子标识计数归一化到每百万总计数和对数转换的唯一分子标识计数。根据平均表达和离散度选择可变基因。进行主成分分析，使用统计最显著的前6个主成分进行UMAP分析。基于主成分分析维度生成聚类和UMAP图。每个聚类内差异表达的标记基因由Seurat函数“FindAllMarkers”鉴定，平均对数倍变化截断值为0.5。将前10个标记基因的比例表达数据制作热图。归一化数据以特征图或小提琴图的形式表示。基因集评分使用VISION R软件包v.2.1.0，按照前面描述的评分算法进行。简而言之，特征基因的表达是基于从最近邻处计算出的预测退出概率进行加权，并对基因集中所有基因进行归一化求和。ABC和ASC基因集已在前面描述过。用VISION包计算每个群体的签名分数并转换为二进制数字向量，并对具有Yates连续性校正的二进制变量进行Pearson 卡方检验，以确定统计意义。采用Bonferroni校正对P值进行调整，P值 <0.05表示显著。

RNA-seq分析

使用HISAT2将基因序列与人类基因组进行了比对(GRCh38;通过Ensembl访问)。用samtools匹配并进行排序和索引，使用featurecots函数对齐匹配到Ensembl参考转录组的reads。使用DESeq2进行库大小的归一化、对数转换和差异表达分析。使用FactoMiner R软件包对对数转换数据进行主成分分析。采用R中的k-means函数进行k-means聚类，聚类数量通过共识聚类确定。用ggplot2 R软件包对数据进行可视化。

统计分析

在小提琴图中，数据以平均值±标准误，或中位数和四分位数表示。多组比较采用Friedman检验和双侧Dunn多重比较检验。双尾采用Mann-Whitney方法比较HNSCC p16− 和p16+患者的hpv特异性IgG抗体滴度和。采用配对双尾t检验比较ASCs在PBMCs和组织中的Ki67表达。在相关分析中，进行了 Spearman相关，并提供了r和双尾P值。双向重复测量采用方差分析和Sidak多重比较检验比较不同B细胞亚群在TME中的分布情况。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。所有统计分析均使用GraphPad Prism v.8.3进行。没有使用统计学方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中对分配也不是盲目的。

总结：

hpv特异性抗体在hpv相关癌症中的作用尚不清楚。然而，两项研究表明，HPV特异性抗体滴度的增加与HPV+患者生存率的提高和复发风险的降低有关。数据显示，TME中hpv特异性抗体滴度与ASCs之间存在明显的相关性。因此，我们很容易推测，TME中hpv特异性ASCs的存在可能也与改善临床结果有关。然而，需要进一步的研究来解决是否增加通过HPV-specific抗体提高患者生存率。