十一月份最新发表在《nature communication》的三阴性乳腺癌亚型研究再次为亚型相关研究提供了新的思路，乳腺癌的亚型研究思路一直都是一个研究热点，先前的研究思路也已经较为成熟，这篇文章将从另一个角度为研究人员分析，乳腺结合先前已经做过的研究来做自己的分析，三阴性乳腺癌(TNBC)亚型包括两个基底样(BL1, BL2)，一个间充质(M)和一个腔内雄激素受体(LAR)亚型。通过对突变、拷贝数、转录组学、表观遗传学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学模式的综合分析，研究人员描述了TNBC亚型的基因组格局。间充质亚型肿瘤表现出高突变量、基因组不稳定、缺乏免疫细胞、低PD-L1表达、整体DNA甲基化降低和抗原提呈基因转录抑制。

研究人员证实，主要组织相容性复合体I (MHC-I)被多冠抑制因子复合体2 (polycomb suppressor complex 2, PRC2)的H3K27me3修饰所转录抑制。在小鼠肿瘤模型中，PRC2亚基EZH2或EED的药理抑制可以恢复MHC-I的表达，并提高化疗疗效，这为在PD-L1阴性间充质肿瘤中使用PRC2抑制剂提供了理论依据。免疫细胞组成的亚型特异性差异和不同的遗传/药理学脆弱性提示了TNBC的额外治疗策略。

摘要：

三阴性乳腺癌(TNBC)是一种异质性疾病，定义为雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)表达缺失，人上皮生长因子受体2 (HER2)扩增。这些受体表达的缺乏和高频驱动改变阻碍了TNBC靶向治疗的发展。目前，化疗和免疫检查点阻断是大多数TNBC患者的主要治疗选择。TNBC显示转录多样性，至少有四种肿瘤固有亚型，包括两种基底样(BL1, BL2)，一种间充质(M)和一种管腔雄激素受体(LAR)亚型。每一种亚型表现出独特的生物学特性和对标准护理化疗的不同反应。雄激素受体(AR)、PI3K/AKT、EGFR、Ras/MAPK、JAK/ STAT和NOTCH通路在一小部分TNBC中发生改变，并已进行了相关的临床研究。尽管在肿瘤表征方面取得了进展，但目前的生物学见解尚未转化为具体的治疗方法，除了PARP抑制剂或BRCA1/2种生殖系载体中的铂剂。最近，针对PD1/PD-L1的免疫检查点抑制剂被证实对TNBC有效，并已获得fda批准，用于与白蛋白-紫杉醇2联合治疗转移性TNBC。然而，只有一小部分患者对免疫检查点抑制有反应，这些反应与PD-L1表达和肿瘤突变负荷(TMB)相关。TNBC亚型与不同的免疫细胞组成有关;尤其引人注目的是间充质亚型(m亚型)中缺乏免疫细胞。这些数据表明间充质TNBC可能已经发展出逃避免疫监视的机制。在这里，研究人员展示了一个全面的亚型特异性分析，突变，拷贝数，基因表达，DNA甲基化，癌症基因组图谱(TCGA)和临床蛋白质组学肿瘤分析联盟(CPTAC)中TNBC患者的蛋白质组学数据，确定了免疫逃逸的潜在机制，并进一步了解TNBC亚型的生物学特性、TNBC细胞系和动物模型识别遗传和药理学弱点，并确定TNBC患者的潜在治疗策略。

结果：

病理引导的多组学鉴别TNBC和TNBC亚型之间的临床病理差异

患者来自TCGA, CPTAC，国际乳腺癌分子分类联盟(METABRIC)，以及MET500，使用临床定义的ER, PR和HER2肿瘤的表达分布指导的基因组数据(图a)。发现TCGA组有192例TNBC患者(17.5%)，CPTAC组有27例(25.7%)，348个来自METABRIC 40(17.6%)和转移性患者(43.5%)群来自MET500 TNBC，结合不同蛋白，突变以及RNA表达情况，研究人员可以看到每种亚型的特异性。接下来又检查了预后是否因亚型而异，通过BL1亚型的风险最低(风险比，HR 0.81)， BL2亚型的发展风险最高(风险比，HR 1.87)(图b，c)。免疫的角度，免疫细胞的存在与生存相关，免疫细胞估值较低的tnbc倾向于更短的无进展间隔(PFI)，而基质免疫细胞肿瘤显示最低的复发风险(图d，e)。

无监督聚类和单细胞RNA分析揭示了肿瘤内部的异质性。根据与其他人之前已经确定了4到6个不同的转录TNBC亚型，研究人员对TGCA TNBC肿瘤进行无监督k-means一致聚类。确定最优数量的集群5基于共识的曲线下的面积分布函数(图 a、b)。注释的共识集群亚型相关性表明,集群1主要是免疫调节(IM)亚型，集群2包括肿瘤混合M和 BL1亚型,聚类3主要为BL1和IM亚型，聚类4主要为BL2亚型，聚类5几乎全部为LAR亚型(图c)。有趣的是，间充质簇(1和2)都缺乏IM亚型调用，这与该亚型6大肿瘤中肿瘤免疫浸润的情况一致。由于有些肿瘤与两个亚型相关，研究人员选择一致性聚类相关性低的肿瘤作为潜在的混合亚型肿瘤。混合亚型肿瘤显示出显著其降低了TNBC亚型和共识聚类的总生存率(图d)，为了确定单个细胞如何促成混合亚型，研究人员评估了6例原发性TNBC患者的单细胞RNA测序(scRNA-seq)(图a)。使用淋巴细胞、单核细胞、肌上皮细胞、内皮细胞和上皮细胞标记物，又识别出了肿瘤上皮细胞(图b)。研究人员对单个细胞进行TNBC分型，并对代表伪体分析的每个肿瘤的所有细胞进行聚合表达。UMAP图显示四种TNBC亚型不同的细胞簇(图c)。个体肿瘤的亚型构成因患者而异，但伪体分析的亚型相关强度与个体细胞亚型组成相关(图d)。这些数据提供了证据，证明具有多重相关性的肿瘤是由混合亚型组成的，并可能反映了肿瘤细胞的可塑性，允许细胞状态之间的转换。

通过整合基因组特征分析鉴定TNBC亚型特征

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为了确定额外的亚型特异性特征和潜在的治疗策略，研究人员评估了TNBC肿瘤中按亚型分层的TCGA中的DNA突变、拷贝数、基因表达、蛋白和磷蛋白表达、DNA甲基化和染色质可及性(图1a)。由于TNBC肿瘤很少是纯的，而是一个连续体的混合物或一部分，所以使用亚型相关强度而不是二元亚型分配来进行所有的鉴别检测。TNBC样本中除LAR肿瘤中HER2亚型富集外，绝大多数为PAM50检测的基底样(basal)(图1b)。M亚型的间质和免疫细胞估计值较低，这表明在这些肿瘤中缺乏免疫细胞。为了更好地了解TNBC肿瘤的细胞组成，研究人员使用来自TNBC和正常乳腺上皮细胞的scRNA-seq数据解旋了大量RNA信号。除了BL2亚型的肌上皮细胞和基质细胞富集外，所有亚型主要由上皮细胞组成(图1b)。m亚型缺乏淋巴细胞和单核细胞特征。正常上皮细胞估计进一步支持BL2-亚型的肌上皮细胞起源和BL1-和LARsubtypes21的腔内祖细胞(L1.2)起源。激素反应的l2型细胞几乎只存在于LAR亚型，支持LAR肿瘤中更分化的雄激素受体(AR)驱动的细胞类型。

类似的反褶积方法用于确定免疫细胞组成，并支持M亚型中不存在抗原呈递和效应免疫细胞类。TNBC肿瘤表现出不同的基因表达模式。由于间充质肿瘤与免疫细胞标记降低相关，所以评估了已知的免疫细胞标记物、免疫检查点表达和抗原呈提表达，并观察到间充质亚型的表达降低(图1b)。在METABRIC组的原发肿瘤和MET500组的转移性肿瘤中观察到类似的肿瘤谱模式(图2a，f)。检测了TNBC亚型的DNA突变和拷贝数改变(CNAs)。与其他癌症类型类似，TNBC患者较高的TMB 显著的无进展间隔(PFI)优于突变负荷较低的患者。按亚型划分，与BL2和LAR亚型相比，BL1和M亚型每个肿瘤有更多的突变。然而，尽管BL1和M肿瘤均显示较高的突变负担，但只有BL1肿瘤显与较好的生存期相关，这表明在标准化疗后亚型特异性长期预后方面存在差异。

与乳腺癌的过去研究结果一致，TP53的改变是频繁的(95%突变/CNA)，并分布在所有亚型中，而激活PIK3CA和ERBB2突变丰富，DNA修复和细胞周期改变在LAR亚型中基本缺失(图1b)。激活的MAPK通路突变相对较少，然而，它们在BL2亚型中显著富集。大约19.7%的TNBC肿瘤有一个调节表观遗传修饰的基因的功能缺失突变。与其他亚型相比,M-subtype肿瘤有更高比例的表观遗传修饰符突变和明显丰富ASXL基因家族突变。此外，M亚型在BAF SWI/SNF核小体重塑复合体成员中富含功能缺失突变(图1b)。这些观察表明，这些染色质重塑基因的功能缺失可能导致M亚型肿瘤中PRC2活性的增加。

DNA的突变模式来源于肿瘤发生过程中导致不同生物学变化的突变过程。因此，研究人员研究了TNBC亚型中单个碱基替换signature的模式。在TNBC中鉴定了四种显著的DNA突变特征(APOBEC胞苷脱氨酶、5-甲基胞嘧啶自发脱氨、DNA错配修复缺陷和同源重组修复缺陷DNA)(图3d)。这些特征先前在没有亚型关联的乳腺癌中被分析过，然而研究人员的数据表明，通过同源重组标记的缺陷DNA修复在BL1-和m亚型中明显更高(图3e)。为了识别与每个亚型相关的复发灶性染色体CNAs。总体而言，M亚型肿瘤显示的CNAs程度最大。符合之前的研究(图3 g ，h)。DNA修复基因的缺失在M-subtype更频繁地观察到。虽然PD-L1的扩增发生在所有亚型中，但与其他亚型相比，m亚型中β -2微球蛋白(B2M)的缺失更为频繁，这可能降低抗原呈现，并影响免疫检查点治疗的疗效。

同时免疫细胞的存在及其在TNBC中的空间分辨率已被证明可以预测预后结果。为了确定肿瘤微环境中免疫细胞是否存在空间差异，研究人员根据之前定义的标准对存档的H&E图像进行评分，并将肿瘤分组。M亚型更容易被识别为margin restricted (MR)和immune desert (ID)

的分组，RNA-seq缺乏免疫细胞转录的signature的数据提示该亚型肿瘤免疫识别缺陷(图1c, d)。

基因表达分析和磷蛋白分析数据确定了独特的亚型特异性靶向途径

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对TNBC亚型的差异表达基因进行了通路单样本基因集变异分析(GSVA)(图1a)。BL1亚型在MYC靶点和细胞周期检查点通路中显示富集。lar亚型在雄激素反应、脂肪酸代谢和氧化磷酸化方面表现出富集。BL2-和M亚型在EMT和TGF-β通路中均富集。除m亚型外，所有亚型都表现出更高的免疫细胞途径富集(抗原加工和呈递、干扰素- γ反应和T细胞信号)。为了确定这些亚型特异性的转录通路是否导致活性蛋白信号，研究人员分析了CPTAC中TNBC肿瘤的RNA和蛋白质水平(图1b, c)。

同时，总体而言TNBC亚型表现出与RNA相似的蛋白通路富集，在BL1肿瘤中细胞周期富集。BL2和M肿瘤中的EMT和整合素通路，以及LAR肿瘤中富集的代谢通路(图2a)。M亚型肿瘤中始终缺乏免疫细胞标志物和抗原呈递(图1c)。综上所述，这些分析突出了TNBC亚型中潜在生物学和不同免疫细胞状态的多样性。为了更好地理解蛋白质信号的差异，研究人员检测了参与DNA修复/细胞周期、PI3K、MAPK和抗原提呈途径的关键蛋白残基的磷酸化水平。DNA修复和细胞周期信号通路在TNBC亚型之间显示出有趣的差异(图2b)。虽然在RNA表达上没有观察到，但M亚型表现出DNA修复信号的增加，证据是ATR (T1989)、ATRIP (S224/S239)和ATM (S1981)的磷酸化水平升高。BL1和M亚型梭形检查点增加，PLK1蛋白和磷酸化水平增加(T210)。BL1亚型显示更高的CCNB2蛋白，BL1和M亚型显示更高的磷酸化CDK1 (T14/T15)，表明这些亚型可能从CDK1/2抑制剂中获益更多。相比之下，BL2亚型的CDK6蛋白水平更高。在BL2和lar亚型中，RB (S807/T826/S795)磷酸化水平较高，而E2F蛋白水平较低，表明G1S检查点完整，可能对CDK4/6抑制敏感。PI3K/mTOR通路主要在BL2-和lar -亚型中被激活(图2c)，这通过磷酸化AKT1(T308/S473)和AKT2 (S474)的增加得到证实。AKT活化可能与PDK1蛋白升高和ERBB2 (T1240)信号通路激活有关。然而，LAR-和BL2亚型之间的下游AKT信号通路不同，BL2亚型中GSK3B (S9/S21)、AKT1S1(T266)和FOXO3 (S294)的磷酸化水平较高(图2c)。LAR和BL2肿瘤也表现出mTOR (S2478/ S2481)、EIF4EBP1 (S65)、EIF4B (S422)和RPS6KB1 (T421)的下游激活。然而，LAR亚型可能更依赖于蛋白翻译，因为该亚型显示最高的40S亚基磷酸化，RPS6 (S236)，表明PI3K和mTORC抑制剂可能都能有效靶向LAR肿瘤。从激活的MEK (pS222/S226)、ERK1 (T185/Y187)和ERK2 (T202/Y204)可以看出，BL2亚型中EGFR/MAPK信号通路表现出更高的活性(图2d)。该亚型KRAS蛋白水平较高，RAF1活性较高(S29/S220)。EGFR信号可能参与了一些活跃的MAPK通路，磷酸化的EGFR (T693/ S1166)和适配器蛋白(SHC1和SOS1)证实了这一点。由于MAPK信号通路升高，BL2亚型可能对EGFR、MEK或ERK靶向治疗敏感。M亚型的抗原加工和递呈蛋白表达较低(图2e)，包括免疫蛋白酶体(PSMB8/9)组分、抗原转运(TAP1/2)和MHC-I抗原递呈(HLA-A/B/C和B2M)。由于免疫激活的TNBC往往对化疗有更好的反应，所以研究人员做出了假设，降低抗原呈提可能为该亚型提供免疫逃逸机制，而重新激活这一途径可以提高标准化疗的肿瘤疗效。

TNBC亚型的整体DNA甲基化模式不同，间充质TNBC中，EZH2靶点和表达抗原提呈基因的特异性甲基化

由于M亚型的特点是缺乏免疫细胞和表观遗传修饰因子的LOF突变，研究人员通过评估TCGA TNBC肿瘤的整体DNA甲基化模式来检查每个亚型的表观遗传格局。通过分析，确定了TNBC亚型之间差异甲基化的CpGs(图a)。la亚型显示了最多的差异高甲基化CpGs，而M亚型显示了最多的低甲基化CpGs(图b)。M亚型显示的差异低甲基化CpGs(74288)大约是BL1-(37,011)、BL2-(23,033)或lar -亚型(30,020)的两倍，并且均匀分布在整个染色体上(图c)。DNA甲基化的整体差异主要发生在启动子3kb的区域。具体来说，大多数lar亚型肿瘤的高甲基化区域发生在启动子中，提示肿瘤分化程度更高(图d)。使用启动子区域(TSS 3kb)中差异甲基化的CpGs来鉴定每个TNBC亚型特有的一致基因表达(图e)。尽管甲基化整体降低，但间质肿瘤在干扰素-γ(IFNG)、免疫检查点基因(CD274、LAG3和TIGIT)和mhc介导的抗原处理呈递(NLRC5、CIITA、HLA-A、HLA-B和TAP1)中表现出甲基化增加和表达降低。在M亚型肿瘤中，抗原提呈基因附近启动子的甲基化显示基因表达降低。通过对一致性甲基化/表达差异进行通路分析，以识别亚型特异性调控(图f)。M亚型在包括免疫信号(干扰素-γ信号、ifn -γ反应、分化T淋巴细胞、TNF反应和免疫细胞因子信号)和抗原处理和呈递的区域内高甲基化。此外，EZH2靶蛋白在高甲基化区域被抑制，表明该亚型中多梳抑制复合物2的调控解除(图f)。为了更好地理解DNA甲基化变化对基因表达和染色质结构的影响，研究人员分析了远端甲基化探针，这些探针与ELMER41鉴定的预测靶基因表达的ATAC-seq峰重叠。仅ATAC-seq能够分离TNBC亚型。提供了染色质可及性可能导致亚型之间表达差异的证据。值得注意的是，M亚型显示出更多的低甲基化区域，与染色质可及性和增强子区域的增加相对应。干扰素-γ可以上调MHC- i42的表达，而转录因子NLRC5和CIITA分别驱动MHC I类和II类的表达。这些发现表明了表观遗传学角度DNA甲基化是M亚型肿瘤抗肿瘤免疫功能的抑制机制。

抑制polycomb抑制复合物2可恢复间质TNBC模型中MHC-I的表达

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图2呃

由于间充质TNBC肿瘤表现出的整体表观遗传差异，于是接下来分析了来自Broad Cancer cell Line Encyclopedia (CCLE)的TNBC细胞系中表明PRC2活性的组蛋白H3 (H3K27me3)上赖氨酸27的DNA甲基化和三甲基化。与其他亚型相比，M亚型TNBC细胞模型显示出最低的中位DNA甲基化(β值)和最高的中位H3K27me3水平(图1a, b)。为了评估抗原提呈水平，研究人员使用泛MHC-I抗体(HLA-A/ b /C)分析蛋白表达。免疫印迹法显示，M亚型TNBC细胞株的MHC-I总水平最低(图2a)。然后在由固定细胞系组成的组织微阵列上进行免疫组化评估细胞MHC-I(图2b)。与其他亚相比，M亚型细胞的MHC-I阳性细胞总数较低(图1c)。此外，流式细胞术检测细胞表面MHC-I的表达显示，M亚型细胞株的MHC-I低表达，部分与未染色对照重叠(图2c)。为了评估PRC2抑制对存活率/增殖的影响，将TNBC细胞用增加剂量的PRC2抑制剂处理，并在4天后相对于对照组测定其存活率。虽然非常低的剂量倾向于增加细胞数量，但TNBC细胞对PRC2抑制剂仅轻度敏感，即使在20μm时，也没有任何化合物使存活率降低超过50%(图2d)。为了识别PRC2复合体抑制的基因，研究人员用两种不同的EZH2抑制剂或EED抑制剂mak683处理M亚型细胞系，然后评估5天后基因表达的变化(图2e和图1d)。研究人员在CAL51、CAL120和BT549细胞系中分别鉴定了1663、1463和2048个与所有抑制剂相同的差异转录本(图2f)。绝大多数差异表达的转录本在PRC2抑制剂治疗后表达增加。对每个细胞系(n = 275，结合)之间增加和共享的转录本的基因本体论分析是在与polycomb阻遏复合物2和H3K27me3相关的通路上，表明PRC2抑制基因的抑制降低(图1e，f).许多额外升高的基因参与免疫信号、抗原呈递、干扰素- γ和炎症反应途径(图2f, g)。与MHC-I (NLRC5)或MHC-II (CIITA)转激活因子表达增加相关(图2h)。为了确定PRC2抑制后MHC-I蛋白水平是否发生变化，研究人员对CAL51、CAL120和BT549细胞株进行单剂量的tazemetostat、pi -1205或mark -683处理，并在1、3、5或7天评估蛋白表达。每一种化合物都能抑制PRC2活性，从H3K27me3在第3天到第7天的稳定下降可以证明(图2i)。当H3K27me3蛋白水平降低时，MHC-I蛋白表达随着PRC2的抑制而增加。每一种抑制剂的细胞表面MHC-I蛋白表达也增加了两倍左右(图2j)。MHC-I表达的增加是针对m亚型细胞的，因为PRC2抑制剂降低了H3K27me3而不改变其他TNBC亚型的MHC-I蛋白水平。因此，在用PRC2抑制剂处理的TNBC细胞中，MHC-I表达的增加有可能增加抗肿瘤免疫应答。

MHC-I位点H3K27me3抑制标记减少EZH2抑制

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为了确定EZH2处理后HLA基因的重新表达是否与H3K27me3的去甲基化相对应，研究人员在DMSO或1 um EZH2抑制剂tazemetostat处理后4天对间充质TNBC细胞株进行H3K27me3染色质免疫沉淀测序(ChIP-Seq)(图1a)。ChIP-seq分析显示，经tazemetostat处理的BT549 (n = 221,518)、CAL120 (n = 54,339)和CAL51 (n = 58,967)细胞中H3K27me3全基因组沉积减少(图2a)。此外，H3K27me3在EZH2 targets43和H3K27结合基因中降低。显著下降的EZH2抑制峰在各细胞系间相似，至少2个细胞系共有约47%的峰，3个细胞系共有16%的峰(图1b)。在H3K27me3、EED和SUZ12靶标中富集了三个细胞系共同的启动子3 kb内的基因集富集分析(图1c)。为了鉴定与H3K27me3降低相关的基因表达变化，研究人员检测了与EZH2抑制降低的启动子H3K27me3峰相关的RNA表达水平。研究人员注意到，在hox相关基因中出现了许多表达增加而启动子H3K27me3减少的基因(图2b)。众所周知，PRC2可以沉默同源盒(HOX)基因位点，也可能有助于抑制MHC-I的表达。

此外，研究人员观察到，在用他泽美司他处理的间充质细胞中，H3K27me3降低，MHC-I基因表达增加，NLRC5反转录(图2b)。MHC-I基因座的基因组快照证实，在HLA-A (BT549)、HLA-B (BT549和CAL120)、HLA-C (CAL120和CAL51)的启动子区域以及MHC-I反转录激活子NLRC5中几个与增强子区域相对应的位置，H3K27me3降低(图1d)。

EZH2抑制增加紫杉醇在同种异种移植模型中的疗效

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为了确定PRC2抑制是否对M亚型有益，研究人员鉴定了一个免疫冷、间充质同系小鼠异种移植TNBC肿瘤模型。与人类细胞类似，PRC2抑制剂也能有效降低小鼠4T1细胞中的H3K27me3(图1a)。4T1细胞表面MHC-I的表达水平也较低，可升高在小鼠中建立同基因的4T1异种移植物，并分别用两周紫杉醇、每日两次他美司他或联合治疗(图1d)。治疗与紫杉醇(平均382 mm3)或tazemetostat(平均433 mm3)单独导致最后适度减少肿瘤体积相比vehicle-treated老鼠(平均643 mm3),而组合(平均237 mm3)明显优于单独每个代理(tazemetostat p = 0.015,紫杉醇p = 0.049)(图1 e)。紫杉醇或他美司他单用并没有降低最终肿瘤重量，然而，联合用药显著降低了肿瘤重量与对照组小鼠相比，肿瘤大小减小(图1f)。研究人员在切除的肿瘤上进行H3K27me3、Ki67和cleaved caspase-3的免疫组化染色。载体治疗的肿瘤体积更大，肿瘤周围有增殖的(Ki-67+)细胞，坏死核心有分裂的caspase-3阳性细胞(图2)。H3K27me3表达的细胞局限于增殖的细胞，在tazemetostat治疗的肿瘤中染色强度较低(图3，4)。在紫杉醇或他美他汀治疗的肿瘤坏死核心外存在cleaved caspase-3(图2，4)。对CD3+ t细胞进行免疫组化，以确定治疗是否改变肿瘤浸润淋巴细胞。每次治疗后，肿瘤内CD3+ t细胞均增加(紫杉醇1.68倍，他美司他1.85倍)，其中联合治疗(2.05倍)增加最大(图1g)，可能导致肿瘤大小减小。

文章小结：

三阴性乳腺癌(TNBC)是一种侵袭性强、进展迅速、生存率低、复发率高、预后较其他类型乳腺癌更差的乳腺肿瘤。随着分子生物学技术的发展，医学界逐步对TNBC开展了分子层面的深入研究。基于TNBC的异质性特征，越来越多的研究把重点放在了TNBC的分子亚型上。这篇文章在先前已经有了很多相关研究的基础上，从突变，免疫的异质性入手，做了大量研究，很多思路都具有借鉴意义。