大家好，看过许多肿瘤分子分型的文章，今天我们换个角度，从肿瘤相关成纤维细胞的角度去解读一篇肺癌肿瘤相关成纤维细胞分子分型的文章，2021年10月7日，由美国哈佛大学医学院、美国麻省总院癌症中心的胡海川博士等研究机构合作在《Cancer Cell》上发表了名为“Three subtypes of lung cancer fifibroblasts defifine

distinct therapeutic paradigms”的文章，这篇文章从肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）的角度创新性的研究出肺癌中的一个新的独立分子分型，系统的阐述了CAFs在功能水平上的异质性，通过对CAFs的分子分型，全面揭示不同亚型的临床意义。

文章亮点：

1.来自非小细胞肺癌患者的CAFs生物库重现了临床CAF异质性

2.NSCLC CAFs的治疗谱揭示了三种不同的功能亚型

3.I型和II型CAFs具有较高的HGF和FGF7表达，对癌细胞有保护作用

4.亚型III 型CAFs与更好的临床反应和免疫细胞迁移有关

前言：

肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）是肿瘤微环境中最主要的成分之一，在肿瘤的发生发展中发挥着必不可少的作用。骨髓和脂肪的局部组织固有成纤维细胞及间充质干细胞是CAFs来源的主要前体细胞。大量研究表明，CAFs并不作为单独细胞在肿瘤周围存在，而是和肿瘤细胞相互作用，促进肿瘤的生长与存活并维持其恶性倾向。肿瘤细胞可以影响CAFs前体的招募，并诱导正常成纤维细胞活化为CAFs；同时,CAFs可以分泌多种细胞因子、生长因子和细胞外基质蛋白质，促进肿瘤细胞的增殖、耐药及侵袭转移，从而影响肿瘤的预后。CAFs还参与血管淋巴管的生成、细胞外基质重塑、免疫抑制以及肿瘤细胞上皮间质转化等有利于肿瘤发生发展的外源性途径，为肿瘤细胞提供了一个良好的微环境。大量研究显示，研发靶向CAFs的药物可以中断其与肿瘤细胞之间的联系，从而抑制肿瘤的生长和转移。因此，深入了解CAFs促肿瘤的作用机制将有利于肿瘤治疗新靶点的发现。

肺癌精准治疗发展史：

靶向治疗：

抗血管生成 在一线及二线治疗中，使用抗血管内皮生长因子（VEGF) 贝伐单抗或抗血管内皮生长因子受体（VEGFR）雷莫芦单抗与化疗联合均可以延长总生存期。 贝伐单抗，目前使用仅限于非鳞癌，联合含铂双药是指南推荐的治疗策略。 尼达尼布，既能够抗 VEGFR 又是多种酪氨酸激酶抑制剂 (TKI)，它与二线化疗方案联用可以延长非鳞癌患者生存期。

EGFR 突变 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）吉非替尼和厄洛替尼在一小部分患者中的疗效获得了戏剧性的突破。在 EGFR 突变的患者中, 比较三种 EGFR TKIs（吉·非替尼、埃罗替尼或阿法替尼 ) 与以铂类为基础的化疗治疗 NSCLC 的疗效。结果见下表： 所有结果表明：EGFR TKIs 战胜化疗成为 EGFR 突变 NSCLC 的一线治疗（更高的 ORR、更长的 PFS、更低的毒性、更好的生存质量）。 不幸的是，肺癌仍然不能被治愈，因为所有的肺癌最终还是会发生肿瘤进展，最常见的原因是突变耐药。50%～60 耐药为T790M 位点突变患者，因 T790M 突变对厄洛替尼、吉非替尼耐药后，第三代 TKIs 奥希替尼可以提高 ORR。因此当一线靶向治疗失败后决定是否使用奥希替尼进行二线治疗时, 必须知道患者 T790M 突变情况，如果发生突变，方可以改用奥希替尼。

ALK 基因突变 ALK 突变的比例在 NSCLC 中约为 3%～5%，克唑替尼是目前治疗 ALK 阳性癌症患者最为有效的药物，服用前必须做 ALK 基因检测，对该类型患者 ORR 达到 50% 左右，与化疗相比，可获得更长的 PFS。

其他除 ALK 基因突变外，肺癌患者还可能存在 ROS1、MET、BRAF (V600E)、HER2 、RET 基因突变，目前以上述基因为靶点的药物尚在临床试验中，并未在国内上市，相关药物及现阶段试验结果见下表：

参考文献：Karnofsky Award 2016: A Lung Cancer Journey, 1973 to 2016，http://ascopubs.org/doi/full/10.1200/JCO.2016.70.4064.

结果解读：

建立一个PDF（患者源成纤维细胞）库，充分捕获非小细胞肺癌CAF异质性，NSCLC CAF异质性决定TKI治疗疗效发现

为了捕获非小细胞肺癌中CAFs的多样性用于功能研究，研究人员从含有EGFR突变或ALK融合等靶向致癌驱动因素的非小细胞肺癌的活检中建立了大量患者源性成纤维细胞(PDF)，首先检查了非小细胞肺癌中CAFs的表型异质性程度。与不同肿瘤间质的不同病理组织学表现相似（图a）。pdf在形态学和生长模式方面表现出相当大的差异（图c），为了更深入地了解这些模型的多样性和保真度，研究人员对这些PDF模型中10个CAF标记的表达进行了表达特征分析（图e），同时还发现COL1A2或ACTA2 mRNA水平与活检时患者年龄的相关性强，根据肿瘤活检部位显示S100A4或PDGFRA mRNA水平的相关性强（图f），研究人员分析了来自切除的nsclc的代表性scRNA-seq数据集的1465个成纤维细胞，包括肺腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌中的CAFs 。统一流形近似和投影(UMAP)显示了7种分子类型，UMAP-1到UMAP-8, UMAP-4由于数据集中单细胞质量较差而被排除在外（图h），这些分析表明，pdf文件差异表达独特的UMAP标记基因，并共同概括了临床NSCLC CAFs的所有七个分子类别(图i)。这些患者由于接受EGFR和ALK治疗后产生了耐药性，研究人员利用二者的耐药水平和耐药机制发掘CAFs的差异，发现了HGF-MET和FGF-FGFR通路，得出结论，CAFs主要利用这两条通路在不同程度上造成的耐药，可进一步影响药物的治疗，这为后续精准药物的研发奠定了很好的基础。

NSCLC CAF异质性决定TKI治疗疗效

在晚期NSCLC中，EGFR的致癌突变和ALK的融合分别存在约20%和5%，为了弄清CAFs是否以及在多大程度上影响对EGFR TKI治疗的应答，研究人员将EGFR突变(以下简称EGFR+)癌细胞MGH707与各种pdf共培养。在没有pdf文件的情况下，EGFR TKI osimertinib (EGFRi)有效地阻断了癌细胞的生长(图a)。与某些pdf共培养基本上维持了EGFRi治疗后癌细胞的增殖，而其他pdf仅提供适度或无保护(图a)。通过相应的pdf条件培养基可以充分复制pdf影响的多样性(图2a)，这在7个pdf结合6个癌症模型的队列中得到了证实(图b)。这些结果表明，pdf在决定egfr治疗的整体疗效方面发挥着重要作用。这种效果是异构的，并且是依赖于PDF的，支持PDF函数的多样性。这些结果也表明pdf的拯救效应主要是由可溶性因子介导的，因此利用培养基对pdf进行高通量分析。研究人员进一步调查了38份来自EGFR+ NSCLC活检的pdf，并评估了它们对三种使用EGFR治疗的EGFR+肿瘤模型的挽救能力(图c)。pdf与碱性NSCLC融合展示了一系列救援效果筛选+治疗非小细胞肺癌细胞株筛选TKI lorlatinib(乙醇),即几个pdf救出所有筛选+癌症模型和其他pdf获救的只有一些碱+癌症细胞系(图d-e)。这里的数据支持癌细胞有不同的能力和偏好利用钙生成的分泌因子。重要的是，CAF功能的异质性neity是一个关键因素，它决定了特定的背景和癌症-CAF交叉的强度，而这些交叉是对整体TKI反应的贡献。

HGF和FGF7的表达定义了三种不同治疗策略的CAFs亚型

由于MET和FGFR反复且有效地介导了cafedriven EGFRi耐药，研究人员接下来根据它们激活这些通路的能力对pdf进行了分类。我们首先在另一种基因环境(ALK+)中测试了PDF的拯救能力，发现无论其原始肿瘤的致癌背景如何，对EGFRi具有显著抗性的PDF也是ALKi的强大拯救者。因此，研究人员分析了所有60份pdf文件的EGFR TKI拯救谱，包括22份来自非EGFR+ nsclc的pdf文件，并确定了三种不同的CAFs功能亚型:亚型I通过MET稳健且广泛拯救EGFR，伴或不伴FGFR(包括CCD19-Lu);

亚型II主要通过FGFR获得较温和的拯救;

亚型III的挽救作用最小(图a-b)。

通过对19份pdf(包括13份来自ALK+肿瘤)的队列研究，我们一致发现，亚型I和II型pdf能够通过ALKi挽救ALK+肿瘤，而亚型III型pdf则可以获得更好的应答(图c)。这三种功能定义的CAF亚型说明了克服CAF介导的治疗耐药的不同治疗策略:需要met加FGFR通路阻断来对抗I亚型CAFs的影响，II亚型CAFs需要FGFR通路阻断，III亚型CAFs不需要联合治疗。至此，研究者将肺癌CAF定义为三种亚型：第I类以HGF-MET及FGF7-FGFR2为主要机制造成耐药，并可给予MET抑制剂和FGFR抑制剂以强化肿瘤治疗；第II类CAF以FGF7-FGFR2为主要机制造成耐药，并可给予FGFR抑制剂以提升肿瘤疗效；第III类CAF不造成或仅导致微弱肿瘤耐药，进而不需要进一步干预。有趣的是，第III类CAF还能增强诱导免疫细胞迁徙，并与肿瘤病灶中CD8+ T细胞丰度相关，可能会对后续免疫治疗策略的改进有帮助。

对肺癌CAF功能亚型与肿瘤耐药、免疫相关的相关性研究

图1

图2

接下来研究人员通过RNAseq分析，对亚型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ做了差异分析，KEGG、GO富集（图1a-b），与亚型Ⅲ PDFs相比，I亚型和II亚型PDFs中有3个通路与基因过表达相关，包括转化生长因子b (TGF-b)信号通路，具有较高的统计学意义(图1c)。研究人员发现它主要是上游但不是下游的基因,在接头的TGF-b1 类型I和II pdf文档,包括decorin(宽带),fibromodulin(作用)和latent-TGF-b-binding蛋白1 (LTBP1)(图1d)。值得注意的是，TGF-b1本身在所有三种亚型CAFs中表达相似(图d)。因此推测，亚型I和II型pdf可能具有较低的TGF-b信号活性，因为它们过表达了这些抑制因子。信号分析证实，TGF-b信号转导的两个关键介质phospho-SMAD2和phospho-SMAD3在亚型III pdf中显著存在，但在亚型I和亚型II pdf中仅有少量存在(图1e)。与亚型IIpdf相比，亚型I和亚型IIIpdf在SMAD2和SMAD3总水平上似乎也具有更高的变异性(图1e)。接下来，研究者研究了TGF-b信号是否控制HGF和FGF7的表达。成纤维细胞TGF-b信号的丢失与小鼠体内HGF分泌增加和旁分泌MET激活有关。在人肺CAFs中，TGF-b1治疗抑制了I和II亚型pdf中HGF和FGF7的表达(图1f-g)，并降低了它们产生EGFRi耐药的能力。总的来说，这些数据表明，CAFs固有的TGF-b信号通路有助于成纤维细胞的功能异质性，部分是通过转录网络，包括ETV1和TBX2。免疫检查点阻断已成为非小细胞肺癌的主要选择。除了癌细胞的内在因素(例如，突变负担)，成纤维细胞也可能影响肿瘤的免疫背景，接下来研究了CAF功能分类是否与患者肿瘤免疫状态相关，所有TIL+活检均有亚型pdf，而亚型Ⅰ和亚型Ⅱpdf仅在TIL活检中存在，尽管可能由于样本量小，差异没有统计学意义(图2a)。与亚型I和亚型ⅡPDFs相比，亚型III PDFs表达了多种对T淋巴细胞和单核细胞具有趋化特性的趋化因子，包括CXCL11、CXCL12、CCL14、CCL17和CCL20，且表达水平更高(图2b)。为了从功能上分析和验证CAFs的影响，研究人员设计了一种体外微流体分析方法来概括免疫细胞迁移过程。简而言之，PDFs被嵌入I型胶原中，这是肺癌组织中表达的主要胶原类型，然后将免疫细胞悬浮培养在模拟肿瘤毛细血管的外周通道中(图2c-d)。总之，这些数据表明，除了确定靶向治疗的反应外，CAF功能分类也与不同水平的免疫细胞浸润有关(图2g)。随着对其生物学和临床影响的进一步了解，这里观察到的现象也可以帮助设计癌症免疫疗法。

判断CAF功能分类与临床预后的相关性

接下来，我们通过分析三个患者队列来检验CAFs的功能亚型是否与患者的临床反应相关。在第一个队列中，我们从12名随后接受共价EGFR TKI治疗的EGFR+ NSCLC患者中获得了治疗前活检培养第一周条件培养液中的分泌组(因此分泌谱更类似于原始肿瘤)(图a)。与先前研究结果一致，对EGFR TKI反应差的患者肿瘤分泌组中HGF和FGF7水平较高(图a)。对于第二组13例患者(图b)，我们从他们首次使用共价EGFR TKI治疗前的活检中建立了pdf文件。通过比较PDFs体外拯救表型和相应患者的临床反应，我们发现，与PDFs分类为亚型或亚型的患者相比，含有亚型CAFs的肿瘤患者更有可能对EGFR TKI产生应答(图b)。对于第三个独立的EGFR+ NSCLC队列，我们分析了从11名患者接受奥西美替尼治疗前后的活检中获得的公共RNA-seq数据集。我们进一步证实，有限应答无进展生存期的NSCLC患者在奥西替尼前活检中HGF和FGF7的表达更高(图c)。对于反应较好的患者(PFS >12个月)，HGF和FGF7的表达通常在奥西替尼(耐药)后活检中增加。一致发现HGF和FGF7的间质丰度在疾病和治疗过程中是动态的(图d)。这些发现表明肿瘤微环境的进化是对治疗压力和/或疾病进展的反应。因此，研究人员进一步分析了来自6名患者纵向活检的pdf，这些患者在两次活检之间至少接受了一条TKI治疗线。从后期活检中获得的pdf通常比最初活检中获得的pdf更有说服力(图e)，研究人员通过4个独立的临床队列验证了三个CAF功能亚型具有知道临床预后的重要价值。

文章小结：

这个研究从成纤维细胞的角度对癌症进行了亚型的分类，不仅在分子分型的角度对癌症治疗进行了研究，还和肿瘤耐药，免疫治疗，患者预后等多个临床治疗的问题相联系，为肺癌精准治疗提供了新的思路，创新性的手段也为之后的肿瘤精准治疗提供了思路与借鉴，有望进一步提高肿瘤的缓解与治疗疗效。