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癌症治疗中的一个关键挑战是检测可能具有耐药性的稀有细胞亚群。随着高分辨率微阵列和测序技术的快速发展，增加了我们对卵巢上皮性肿瘤标志物的了解。今天给大家分享的这篇文献是发表于Oncogene（IF: 9.867）上的关于卵巢上皮性肿瘤的单细胞转录组结合常规转录组的一项研究，提供了不可多得的卵巢上皮性肿瘤的单细胞测序数据，同时我们也可以一起来学习一下这篇文章的研究思路。
单细胞RNA-seq识别卵巢上皮性肿瘤复发的起因
研究背景
卵巢上皮性肿瘤（EOC）是所有妇科癌症中最致命的癌症类型。由于早期无症状，80%以上的EOC患者晚期(III或IV期)才被确诊并伴有腹膜转移现象。EOC对化疗药物高度敏感，但是复发率也高。在大多数晚期EOC患者中，中位无复发间隔期（RFI）为16-22个月，5年生存率<30%。在几乎所有癌症类型中，转移性复发是癌症相关死亡的主要原因。从原发性肿瘤中逃逸出来的播散肿瘤细胞（DTC）和播散肿瘤细胞群被认为是转移的起因，此外，肿瘤转移还与肿瘤微环境（TME）以及上皮-间质转化（EMT）相关。因此研究人员提出识别出EOC中这一关键的肿瘤细胞亚群可能为预防复发的治疗干预提供新的靶点。
结果
1. 卵巢上皮性肿瘤单细胞图谱
作者首先对8个卵巢上皮性肿瘤（EOC）患者样本的13369个细胞进行了单细胞转录组测序，其中包括四个原发肿瘤（Ps）、两个未经治疗的腹膜转移肿瘤（Ms）和两个复发肿瘤（Rs）（图1a）。通过无监督共识聚类共鉴定出14个不同的细胞类群，其中有8个细胞群中的细胞主要来源于同一个样本（图1b），且这8个细胞群都是上皮起源（EPCAM）。其他6个细胞群由来自不同患者的细胞组成。如图1c所示，通过对已知标记基因的分析可以确定这6个细胞群分别为癌相关成纤维细胞（CAF，包含两个群）、T细胞、巨噬细胞、内皮细胞和正常卵巢组织细胞。
目前主要有两种方法鉴定上皮肿瘤细胞：一种是基于拷贝数变化和点突变，另一种则是基于上皮细胞标记基因的表达情况。从图1c中可以观察到上皮细胞标记基因和其他细胞类型标记基因的表达显著不同，因此作者认为上皮起源的8个细胞群是肿瘤细胞，其他细胞群则被归类为基质细胞，即共鉴定出了10364个肿瘤细胞和3005个基质细胞（图1d）。作者还注意到，肿瘤细胞主要根据其样本来源进行聚集，而基质细胞则主要根据其特定的细胞类型进行聚集，每个细胞群中包含来自不同样本的细胞，这一现象说明癌症患者的个体间异质性非常显著。
对基质细胞的进一步聚类分析显示，根据其基因表达差异，THY1+ CAF有两个亚群，而CD2+ T细胞可根据T细胞表达状态分为细胞毒性T细胞和耗竭性T细胞。如图1e，每种细胞类型的比例在不同的肿瘤类型中差异很大。例如，在未经治疗的腹膜转移肿瘤中，肿瘤浸润免疫细胞的比例远高于其他肿瘤类型，而在所有肿瘤类型中，复发肿瘤中的肿瘤细胞比例最高。
2. 对转移瘤进行细胞轨迹分析以确定起始细胞
为了揭示两种未经治疗的腹膜转移瘤（M1、M2）和两种复发瘤（R1、R2）中肿瘤细胞的发育顺序，作者使用基于不同原理的两种无监督算法进行了独立的细胞轨迹分析。第一种算法是“RNA速度”分析，它可以通过区分scRNA-seq数据中未剪切的和成熟的mRNA的相对丰度，以预测单个细胞的发育（图2a-d）。第二种算法是Monocle拟时间分析，它可以定量测量单细胞在生物过程中的进展，尤其是增殖和分化，通过发育调控基因表达的变化确定细胞命运（图2e-h）。每个转移性肿瘤的细胞根据拟时间轨迹排列（图2i–l，顶部轨迹），拟时间起始分支上的细胞则被定义为所有后续细胞的起始细胞亚群。为了比较这两种算法的结果，作者还使用RNA速率识别的细胞群的名称沿拟时间轨迹给细胞着色（图2i–l，中间轨迹）。结果发现每个肿瘤细胞群的预测伪时间顺序与其估计的细胞状态速度一致。综合上述结果，两种算法起始位置中出现的重叠细胞被确定为每个转移性EOC肿瘤中起始细胞（图2i–l，底部轨迹，椭圆中的红色细胞群）。
作者又对保守标记基因进行了功能分析，结果表明，未经治疗的腹膜转移瘤（M1、M2）中的起始细胞主要与免疫反应有关（如CD81、HLA-A、HLA-DRB1、XBP1、CFB、C3），复发肿瘤（R1、R2）中的起始细胞则主要与细胞周期有关（如MKI67、CKS2、ANLN、CDC20、CDCA8、CENPF）（图3a）。在这两种转移性肿瘤之间并没有发现共同的转录特征，但它们中的免疫细胞比例都相当高，而在任何复发肿瘤样本中几乎没有观察到免疫细胞（图1e）。作者在进一步对腹膜转移肿瘤中免疫应答基因的研究中发现T细胞和肿瘤细胞之间存在受体-配体相互作用，包括T细胞通过淋巴毒素和肿瘤坏死因子（TNF）介导的细胞毒性以及肿瘤细胞通过趋化因子介导的T细胞募集（图3b）。此外，在两个复发性肿瘤样本中，G1/S或G2/M期细胞在起始细胞群中富集，但在腹膜转移肿瘤中少见且分散存在（图3c）。
3. 追踪原发性肿瘤中的转移起始细胞
为了追踪原发性肿瘤中转移起始细胞的来源，作者首先分析了每个原发性EOC样本中肿瘤细胞的基因表达情况。通过无监督聚类，从四种原发性肿瘤中鉴定出了23个特征基因。为了对这些特征基因进行功能注释，作者对前100个共表达基因进行GO富集分析，一共定义了7种类型基因表达模式（如图3d）。然后作者又重新定义了四种原发性肿瘤中保守的转移起始特征基因，绘制了转移起始基因集或复发起始基因集（图3f）的单细胞表达评分（图3e-f），发现复发起始特征基因在“cycling”或“stress”类型中富集（图3f）。上述结果表明，任何类型的肿瘤细胞都可以在化疗前进行转移，但是只有特定的肿瘤细胞亚群可以在化疗后存活，从而引发肿瘤复发。
通过之前的分析，复发肿瘤中的起始细胞被证明是cycling细胞。然而，引发复发的DTCs不太可能起源于原发肿瘤的cycling亚群，因为原发肿瘤中的cycling细胞是化疗的靶点，且其生存几率较低。因此作者猜测可能是non-cycling 或者 low-cycling的DTCs在药物治疗后存活下来，并获得进入细胞周期的能力，从而引起了肿瘤的复发。为了揭示cycling类型复发起始细胞的基因表达情况，作者将复发肿瘤的起始细胞与原发肿瘤的cycling细胞进行了比较。在复发肿瘤的起始细胞中鉴定了45个基因（图4a），这些基因主要与色素颗粒、应激反应和蛋白质折叠功能有关。图4b的t-SNE图谱显示了这45个标记基因在四个原发性EOC肿瘤表达水平。
4. CYR61在复发起始因子中高度表达，并与耐药性相关
作者根据耐药性特征以及Puram等人报道的肿瘤内部分EMT（p-EMT）特征，评估了“stress”亚群中肿瘤细胞的复发相关特性。与来自其他肿瘤内基因表达模式的肿瘤细胞亚群相比，“stress”亚群具有相对较高的耐药性得分（图4c）。因此EOC的复发始作俑者很可能是来自原发肿瘤的“stress”亚群，这可能是防止EOC复发的一个重要治疗靶点。于是作者分别从四种原发肿瘤的“stress”亚群中鉴定出12、7、13和22个标记基因；鉴定标准有两个，一个是在“stress”亚群中超过30%的细胞中表达，第二个则是在其他亚群中无表达或低表达。其中CYR61被确定为四个EOC患者样本中“stress”亚群的常见生物标记物（图4d-e）。
CYR61编码的是一种分泌的细胞外基质（ECM）相关蛋白，调节多种细胞功能，包括细胞粘附、迁移、增殖、凋亡、衰老和分化，CYR61表达已被证明在多种癌症中与耐药性相关。作者通过基因网络互作分析进一步明确了几个耐药基因信号通路和CYR61表达之间的直接和间接联系（图4f）。CYR61染色结果显示，与原发肿瘤相比，复发肿瘤中的CYR61+细胞百分比显著升高（>80%）（图4g）。CYR61+细胞的高百分比与肿瘤细胞的耐药性增加呈现正相关性（图4h）。此外，作者还进行了GSEA分析，结果发现CYR61+细胞亚群和复发起始亚群都表现出20种耐药相关途径的显著上调（图4i）。
5. RGS5+CAF亚群促进肿瘤细胞的转移
作者为了探究肿瘤组织中CYR61的总体表达水平，进一步分析了8个EOC样本的bulk RNA-seq数据，鉴定出了12个应激相关基因（包括CYR61），并观察到许多与CAF相关的ECM编码基因（如COL1A1、COL1A2、COL3A1、FN1）高表达（图5a）。根据不同的基因表达情况，作者将EOC中的CAF细分为两个亚群。富集分析显示，CAF2的标记基因在ECM和细胞粘附功能中富集，而CAF1的标记基因在响应刺激、血管生成和抗凋亡等功能中富集（图5b）。因此，作者认为CAF，尤其是CAF1，是原位肿瘤生长和癌细胞转移扩散关键因素（图5c）。
相关性分析显示，整个肿瘤组织的EMT评分与CAF1与肿瘤细胞的比率高度正相关，同时纯肿瘤细胞的EMT评分与CAF1的数量也显著相关（图5d-g）。作者进一步探索了8个EOC样本中最具代表性的CAF1生物标记物，发现两个候选基因RGS5和COL4A1在CAF1中高表达，通过比较这两个基因在CAF群中的表达特异性，最后RGS5被确定为CAF1中特异性的生物标记物（图5h-j）。
6. CYR61/RGS5表达水平反映了EOC的RFI
在确定了两个肿瘤内细胞亚群的生物标记物后，作者首先在8个EOC样本中进行CYR61和RGS5的IHC联合染色，以验证样本制备和scRNA-seq数据分析的可靠性（图6a）。很明显，IHC结果中CYR61肿瘤细胞和RGS5+CAF的百分比与scRNA-seq结果中的百分比一致，并验证了CAF1通过肿瘤细胞TME相互作用促进肿瘤细胞的EMT。对比EOC的组织学亚型在EOC RFI分析的分类能力，说明了从scRNAseq中发现的生物标记物在EOC的所有组织学亚型中具有很强的复发预测潜力（图6d-f）。
小结
EOC对化疗很敏感，但大多数患者最终会复发并产生耐药性。认识原发性EOC肿瘤中的复发起始细胞对指导临床实践具有重要意义，作者通过采用scRNA-seq技术结合常规转录组数据分析克服了肿瘤个体之间异质性的影响，最后确定了在不同的EOC亚型中，复发通常是由特异性表达CYR61的耐药原发肿瘤细胞亚群引起的。此外，还发现RGS5+CAF亚群对肿瘤转移有促进作用。
