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在介绍这篇文章之前，我想介绍这篇文章的“美女”通讯作者Aviv Regev。
生物学家，人类细胞图谱（HCA）创始成员之一。她和Teichmann现在是人体细胞图谱计划（Human Cell Atlas）的联合负责人。该项目计划对人体各种细胞的RNA进行测序，然后使用这些基因表达谱将细胞分类，定义新的细胞，并绘制所有细胞及其分子在空间上的组织方式。Regev还热爱细胞。无论怎么看，对她来说，细胞都是神奇而迷人的。
结果解读：
为了描述持久性细胞的增殖动力学，作者研究了PC9肺癌细胞对第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂osimertinib的反应。PC9肺癌细胞编码表皮生长因子受体(EGFR)的基因存在致癌突变。作者在最大效应(Emax)浓度(300 Nm)下处理细胞，并使用活细胞成像来量化治疗过程中分裂事件的数量和时间，因为细胞要么经历细胞死亡，要么受阻，要么形成可见的集落(图1A)。为了确保来自集落形成谱系的细胞在作者的分析中不被过度表达，作者只跟踪了每个谱系中的一个细胞。只有8%的细胞系产生了持久性细胞，其定义是在药物治疗的第14天存活的细胞(图1B)。从根本不分裂的持久性细胞到经历了7次分裂，持久性细胞分裂谱显示了广泛的异质性(图1B)。这与未经处理的亲代细胞群体形成对比，在亲代群体中，所有细胞都经历了细胞分裂(图1C)。与以前报道的集落形成持续细胞很少一致，不到初始细胞群体的0.5%(持久群体的13%)产生了超过6个细胞的多细胞持久集落(图1D)。因此，持续细胞包含一种在药物治疗早期出现的罕见的增殖亚群。
作者开发了Watermelon系统，这是一种高度复杂的条形码慢病毒表达文库，用于同时追踪每个细胞的克隆起源以及增殖和转录状态。要确定细胞在药物治疗中能否存活并恢复增殖能力的机制，需要在药物治疗前和药物治疗期间测量这些稀有细胞的细胞和分子特性。为此，作者开发了Watermelon系统，这是一个具有绿色和红色荧光报告的高复杂性慢病毒条形码文库，用于同时追踪克隆谱系以及种群中每个细胞的转录和增殖状态。作者通过在mNeonGreen蛋白的3‘-非翻译区定位克隆特异性表达的DNA条形码来实现谱系追踪，并通过稀释强力霉素(Dox)诱导的H2B-mCherry转基因来监测增殖历史(图1E)。作者生成了一个包含500多万个条形码的Watermelon系统文库，并用它转导了10,000个感染复数(MOI)小于0.3的PC9细胞，以最大限度地减少克隆之间的条形码重叠。
作者通过比较短时间循环和非循环的持续增殖群体的osimertinib敏感性，测试增殖性持续细胞是否出现对EGFR抑制的稳定和较低的敏感性。作者用奥西美替尼处理Watermelon-PC9细胞14天，前三天在培养基中加入Dox。经过11天的Dox处理，在此期间，mCherry只在增殖细胞中被稀释，作者对循环和非循环的持久细胞进行了分类(图1F)。循环和非循环的持久群体都迅速恢复了药物敏感性，这表明在持续药物治疗下循环的能力是可逆的，而不是遗传突变机制(图1G)。为了确定持久细胞增殖能力的潜在机制，作者用单细胞RNA测序技术(scRNA-seq)分析了56,419个Watermelon-pc9持久细胞在奥西美替尼治疗14天的四个时间点(0，3，7和14天)的表达(图2A)。作者使用已发表的signatures将每个细胞分配到特定的细胞周期时相(图2B)，根据scRNA-seq检测到的表达条形码(图2C)将细胞归属于谱系，并使用力定向布局嵌入(图2D)。作者还根据相关细胞的轮廓将其归类(图2D)。与以前的报道一致，奥西美替尼在治疗的第3天和第7天诱导G1期阻滞。在第14天，与中度循环细胞和非循环细胞(循环、中度循环细胞循环持续细胞分别有55%、36%和18%的细胞处于G2/M或S期)相比，循环持续细胞(根据mCherry稀释度定义)具有更高的基于表达的细胞周期分数(图2B) 与作者基于成像的分析一致，在第14天出现在持续细胞内的条形码中，只有不到12%的条形码是大规模克隆扩增的一部分(定义为在14天的检测过程中至少增加了5倍) ( Fig.2C )。
ScRNA-seq图谱表明药物治疗后细胞状态逐渐改变，循环和非循环持久细胞遵循不同的转录轨迹，周期持久细胞的子集类似于未经处理的细胞(图2D左)。治疗过程中克隆大小动态检测显示克隆扩张，其中在循环持续细胞中观察到的克隆大小增加最大 (图2D，中)。几乎三分之二的克隆有单一的命运，要么只产生循环的，要么只产生不循环的持久性细胞，而多命运谱系的出现频率远远低于预期(图2D，右)。第14天的单个克隆的大小在重复之间高度相关(图2E)。
循环持续细胞比非循环持续细胞表现出更高的谷胱甘肽代谢和NRF2信号的表达，而非循环持续细胞的胆固醇稳态、干扰素-α和Notch信号特征的表达更高(图2F) 在较大克隆的细胞中高表达的前十个相关基因中，有五个是氧化应激诱导转录因子NRF2的靶标(Fig. 2H)。与最近作者的差异表达分析和NRF2在微小残留病中的作用的报告一致，敲除了编码NRF2负调控因子的Keap1，增加了循环持续细胞的比例(图2I)。用荧光ROS报告器CellROX对奥西美替尼处理的细胞进行分析，发现ROS水平随时间显著增加(图2J)。与观察到的两个持久亚群之间的表达差异一致，第14天的循环持续细胞表现出不到非骑行人群测量到的ROS水平的三分之一(图2K)。此外，当作者从第3天开始用活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)治疗来缓解ROS (图2L)，或者通过稳定过表达GPX2(图2M)时，循环持续细胞比例明显增加。用抑制对谷胱甘肽合成至关重要的胱氨酸-谷氨酸逆向转运蛋白系统的erastin治疗，反过来减少了循环持续细胞的比例(图2N)。
对229种量化代谢物的主成分分析(PCA)将循环持续细胞、非循环持续细胞和未处理群体分开(图3A)。有56种代谢物在三个种群之间差异丰富(图3B)。特别是，作为线粒体β氧化底物的肉碱连接脂肪酸在循环持续者中比非循环持续者中要丰富得多(图3C)。作者研究了放射性标记棕榈酸氧化成3H2O的情况，以评估脂肪酸氧化(FAO)，并确实发现在奥西美替尼治疗下，FAO的含量随时间增加(图3D)。接下来，作者测试了调节粮农组织途径是否会影响持久者的增殖能力。在Watermelon-PC9细胞中过表达CPT1A，一种促进脂肪酸转移到线粒体的限速酶，导致奥西梅替尼处理14天后循环持续细胞的比例增加了50%以上(图3e)。与依托莫昔尔共处理11天，在对未处理细胞有最小抑制作用的浓度下，显著减少循环持续细胞的比例(图3F)和过敏性细胞的总体比例(图3G)。与之一致的是，敲除CPT1C（一种在人类肺癌17中上调的基因亚型），而不是CPT1A，导致循环周围细胞的比例减少(图3H)。为了研究这些发现对其他周围细胞的共性，作者从EGFR驱动的肺癌(PC9和HCC827)、HER2驱动的乳腺癌(BT474和EFM192A)、BRAF驱动的黑色素瘤(A375和COLO858)和结直肠(HT29)细胞系中另外建立了7个Watermelon模型，用临床相关的激酶抑制剂(osimertinib、rapatinib或dradfenib)处理细胞10天，并对这些细胞进行分类(图3I)。与之前的报告一致，这些图谱按细胞特性分组，而不是按治疗分组(图3J)。在检测到足够数量(大于50个)的循环持续性细胞的五个模型中，有四个模型中持续性细胞的脂肪酸代谢(FAM)特征比非循环的相应细胞高(图3k)。与PC9细胞相似，A375黑色素瘤细胞循环持续细胞与来自同一模型的非循环细胞相比，表现出更高的抗氧化反应基因和NRF2信号的表达(图3L，M)。相反，循环HT29和HCC827持久细胞上调了其中一个，但不是两个，这些ROS相关的信号(图3L，M)。黑色素瘤(A375)和结直肠癌(HT29)循环持续性细胞的ROS水平也明显低于同一细胞系的非循环细胞(图3n)。
EGFR抑制也在体内引起了类似的转变，就像在携带可诱导突变EGFR(L858R)的TRP53基因敲除小鼠模型中用奥西美替尼治疗的微小残留病(图4A)一样。一旦小鼠患上肺腺癌，作者就用奥西美替尼治疗它们，直到肿瘤消退稳定下来，这表明残留病灶很小(图4A)。来自处理和未处理小鼠的样本的批量RNA测序显示，虽然处理导致整体细胞周期和EGFR信号特征的强烈下降，但极小的残留疾病细胞上调了ROS和FAM基因特征的表达，这与作者的体外发现(图4B)一致。FAM和ROS通路信号在从治疗初期到残留病灶再到进展的治疗过程中都显著且逐渐增加(图4C，D)。ROS和FAM基因表达的增加与细胞增殖有关，并且在循环细胞中高于非循环的持久细胞(图4E，F)。值得注意的是，在接受治疗的样本中，ROS和FAM signatures的相关性比未接受治疗的样本更强（图4G）。为了测试患者对其他致癌激酶抑制剂的反应是否有类似的状态，作者分析了另外两种肿瘤类型的整体RNA-seq图谱：在基线或接受BRAF抑制剂和MEK抑制剂22治疗22天后收集的braf驱动的黑色素瘤；以及在基线治疗或拉帕替尼治疗2-3周后患者的her2驱动的乳腺癌（图4H）。在HER2+乳腺癌中，FAM和ROS信号诱导仅与药物治疗相关（图4I）。
本文小结：
总而言之，作者的结果说明了一种方法，不仅可以理解持久者循环能力的基础是什么，而且还可以了解是什么驱动了其他临床上重要的持久性特征，如复发时间，从而为开发延缓疾病复发的治疗方法迈出了重要的一步。
