大家好！今天要介绍的这篇文章说新也不新，说普通也不普通。scRNA-seq、EGFR突变、免疫治疗这三个词大家都耳熟能详，这篇文章将这三点充分揉合在一起，揭示了EGFR突变塑造的肺腺癌免疫抑制微环境是免疫治疗效果差的因素之一。行文间无不体现作者是肺癌领域的深耕者，因此，研究肺癌的同学要好好研读了！另外，常见基因突变对肿瘤微环境的影响会不会成为你挖掘公共数据的思路呢~

文章标题

背景知识

免疫疗法对EGFR突变的非小细胞肺癌(NSCLC)患者效果较差。其中，PD-L1低表达和肿瘤突变负荷是潜在机制。而肿瘤微环境(TME)是影响免疫治疗的另一个重要因素，迄今尚未得到全面了解。因此，作者发起了这项研究，从细胞组成和功能的角度描述不同EGFR突变状态下肺腺癌(LUAD)的微环境特征，以更好地了解其免疫情况。

结果解读

肺腺癌的全局免疫景观

为了评估EGFR突变的肺腺癌（LUAD）微环境的免疫景观，作者从8名未接受过治疗的LUAD患者收集了9个肿瘤样本（5个EGFR阳性和4个阴性），用于单细胞RNA测序和生物信息学分析（图1A）。两个EGFR阳性样本来自1名有多个结节的患者：一个为EGFRL858R，另一个为EGFR19del。

作者总共分析了40,799个单细胞，包括来自4个EGFR阴性样本的18,704个细胞和来自5个EGFR阳性样本的22,095个细胞，确定了八种主要细胞类型：上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、单核细胞、T/自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞、B/浆细胞和肥大细胞。作者对每组和每位患者进行了全局细胞类型注释（图1B、D和E）。微环境中这些细胞类型的比例在EGFR阳性组和EGFR阴性组之间存在显着差异（图1C，D）。

比较有意思的是，EGFR阳性和阴性组中，T/NK细胞均占主导地位，且存在相似的比例。然而，EGFR阳性组的单核细胞、肥大细胞和内皮细胞的比例较高，而EGFR阴性组的中性粒细胞和成纤维细胞比例较高（图1D）。

不同EGFR状态的上皮细胞驱动微环境的多样性

总共获得9067个上皮细胞，分成13个簇（图2A）。作者使用R包infercnv将上皮细胞分为肿瘤细胞和正常细胞（图2D-D），并将>50%的肿瘤细胞群定义为肿瘤簇，将其他细胞群定义为正常簇。根据差异丰度测序（DASeq）分析，EGFR阳性组富集C1和C5，而EGFR阴性组富集C0、6、8和11。

富集分析结果显示EGFR阴性组C6上调干扰素(IFN)α/γ响应和PI3K-AKT-MTOR相关信号通路（图2E）。基因表达分析显示，CCL18、CXCL1和CXCL3在EGFR阳性特异性簇中的表达高于阴性特异性簇（图2F），与免疫抑制相关。而EGFR阴性特异性簇C6表现出CXCL5、IL-7、IL-18和IL-32的高表达（图2F）。IL-7是CD8+记忆T细胞增殖所必需的，而IL-18是活化CD8+ T细胞存活和产生IFN-γ所必需的。因此，野生型EGFR的肿瘤细胞可能具有更强的促进CD8+ T细胞增殖的能力。

作者进一步将公共数据集中免疫治疗后响应和非响应样本的上皮细胞与本研究中EGFR阳性和阴性状态的未治疗样本进行比较，EGFR阳性特异性簇C1和5与来自非响应患者的上皮细胞相同（图2H）。这些结果与假设一致，即EGFR阳性LUAD可能对免疫治疗反应不佳。

轨迹分析显示，EGFR突变驱动正常上皮细胞分化为代谢特征不同的两组：fate1（EGFR阴性组）或fate2（EGFR阳性组）（图2I），说明代谢特征也可能对EGFR突变LUAD的微环境产生负面影响。

CD8+ TRM细胞在EGFR野生型LUAD中富集和激活，CD8+ TRM细胞可能通过CXCL13分泌促进三级淋巴结构的生成

作者把T和NK细胞分为CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和NK细胞。接下来，CD8+和CD4+ T细胞分别分成9个和8个亚群（图3A、C）。在EGFR阴性组中，CD8+ TRM细胞、CD8+循环T细胞、CD4+ TRM细胞和Th1样细胞的比例较高（图3B，D）。

CD103是TRM细胞的表面标志物，CD103+ CD8+ TRM细胞与多种癌症免疫治疗后生存率的提高有关。此外，许多抑制性免疫检查点，例如PD-1、LAG3和TIM3在TRM细胞中高度表达。mIHC结果显示，EGFR阴性组中CD103+ CD8+ T细胞的比例更高（图3E）。此外，EGFR阴性组CD8+ T细胞中PD-1、LAG3和TIM3的表达较高。在scRNA-seq数据中，抑制性和激活性免疫检查点在CD8+ TRM细胞中都高表达，而EGFR阳性细胞中不存在这些免疫检查点（图3F）。这些结果表明，CD8+ TRM细胞在EGFR野生型LUAD的TME中富集，与mIHC数据一致。

作者进一步研究T细胞分泌的细胞因子，发现CXCL13在EGFR阴性组的CD8+ TRM中表达较高（图3G）。CXCL13介导B细胞向肿瘤的募集，对于三级淋巴结构(TLS)的形成至关重要，其密度是几种癌症类型对免疫治疗反应的阳性预测因子。mIHC结果显示，EGFR阴性组CD8+ T细胞中CXCL13的表达和TLS密度显着高于EGFR阳性组（图3E，H）；这种差异在基质区域更为显着，表明CXCL13可能促进肿瘤基质区域的TLS形成。

为了验证这一发现，作者分析了一个包含3个接受pembrolizumab治疗的样本的外部数据集。作者发现CD8+ TRM细胞在EGFR阴性组中的比例高于EGFR阳性组（图3I-K）。在来自EGFR阴性组的每个样本中都发现了CD8+ TRM细胞。此外，CD8+ TRM细胞是响应性结节的主要CD8+ T细胞（图3I-J）。因此，基线肿瘤组织中CD8+ TRM的富集可能是对ICI反应的预测因素之一。

巨噬细胞可能在EGFR阴性LUAD中募集和扩增CD8+TRM细胞

作者将巨噬细胞分为8个亚群（图4A、D）。EGFR阳性组肺泡巨噬细胞C1和C3的比例较高，而EGFR阴性组的CHIT1_TAM簇比例较高（图4B）。DASeq分析表明EGFR阳性特异性区域与肺泡巨噬细胞C1和C3重叠，EGFR阴性特异性区域与CHIT1_TAM重叠（图4C）。

基因表达分析显示，EGFR阳性组巨噬细胞高表达CCL2、CCL13、GDF15、CCL23、CXCL17（图4E），与EGFR突变的LUAD形成免疫抑制微环境有关。EGFR阴性组高表达CXCL9、CXCL10、CCL3、CXCL5、CXCL12，与抗肿瘤免疫响应有关。

在评估免疫治疗后的既往数据时，整合的巨噬细胞主要分为肺泡巨噬细胞和TAM（图4F）。作者分析了治疗后的TAM，响应样本的TAM特异性高表达CCL7、CXCL9和CXCL10，并与来自EGFR阴性初治组的TAM重叠（图4G）。进一步分析TAM发现高表达的亚群CCL7_TAM（图4H）。据报道，CCL7与人NSCLC肿瘤活检中的CD103呈正相关，这表明EGFR阴性组中CCL7表达较高的巨噬细胞可能促进TRM扩增。

CAF可能有助于在EGFR野生型LUAD将CD8+ T细胞转化为CD8+ TRM细胞

成纤维细胞分为8个簇，并标注为成纤维细胞、肌成纤维细胞和CAF（图5A、B）。CAF是TME的核心元素，并与癌细胞和TME的其他成分相互作用。作者将CAF分为肌纤维母细胞CAF(myCAF)、抗原呈递CAF（apCAF）和炎性CAF(iCAF)（图5C、D）。EGFR阴性组的apCAFs、myCAFs-1和myCAFs-2的比例高于EGFR阳性组。两组iCAF的比例相似（图5E）。DASeq还显示apCAFs、myCAFs-1和myCAFs-2的分布与EGFR阴性特异性细胞的分布重叠（图5F）。apCAFs的Hallmark分析显示该簇富含促炎途径（图5G）。

对初治和治疗后样本的进一步比较表明，在ICI治疗后，成纤维细胞存在于非响应样本中，但很少出现在响应样本中。非响应样本中的主要和次要细胞分别是LEPR+ CAF和myCAF（图5H，I）。因此，残留的LEPR+ CAF可能会导致免疫耐受。LEPR是间充质干细胞（MSCs）的标志物，LEPR+ CAFs可以被认为是MSC样CAFs。未经治疗的样本中的iCAF和部分成纤维细胞与组合池中的LEPR+ CAF相关（图5J）。进一步分析表明，这些残留的CAF特异性表达MMP2、CXCL14、CXCL12、FAP、TNFSF13B、BMP5和HGF（图5K）。与免疫抑制和治疗耐受有关。

TGF-β信号传导对于TME中MSCs分化为CAFs至关重要。作者发现EGFR阴性组的iCAF和myCAF比EGFR阳性组更能表达TGF-β。TME中丰富的TGF-β也可以诱导CD103在CD8+ T细胞表面的表达。因此，来自EGFR阴性组的CAF可能具有诱导CD8+ T细胞转化为CD8+ TRM细胞的能力。

B细胞在EGFR阴性LUAD的构建TLS

B细胞分为10个簇（图6A、B）。EGFR阴性组的浆细胞比例高于EGFR阳性组（图6C）。免疫抑制因子CXCL17和GDF15的浆细胞表达在EGFR阳性组中较高，而与CAF激活有关的CCL18和GRN在EGFR阴性组中较高（图6D）。

B细胞是TLS最重要和最基本的组成部分。细胞-细胞互作分析表明，B细胞可以通过与受体结合的各种细胞因子配体被CHIT1_TAM、iCAF和LAMP3+ DC募集（图6E）。表达CCR7的B细胞可以通过分泌CCL21的CHIT1_TAM募集。EGFR阴性组的B细胞更高表达CCR7，同时CHIT1_TAM特异性表达CCL21（图6F）。此外，与TLS形成的CD79A在EGFR阴性组的B细胞中比EGFR阳性组的表达更高（图6F）。这些数据表明，来自EGFR阴性组的B细胞可能已被CHIT1_TAM募集，并有可能在TME中构建TLS。

细胞相互作用网络因EGFR状态而异

作者使用CellPhoneDB来研究LUAD微环境中的细胞间通信。细胞通讯类型因EGFR突变状态而异。由于CD8+ TRM细胞可能是负责免疫治疗疗效的主要免疫细胞，作者分析了CD8+ TRM与其他细胞类型之间的特定相互作用（图7A）。在EGFR阴性组中注意到CD8+ TRM细胞与CHIT1_TAM、LAMP3+ DC和成纤维细胞的相互作用。CHIT1_TAM可以通过CXCL9/CXCL10–CXCR3结合来吸引和激活TRM细胞。LAMP3+ DC可能通过EGFR阴性组中的IL-15和IL-15R结合促进TRM扩增和稳态存活。同时，我们的EGFR阴性组中的成纤维细胞也通过TGFB2-TGFBR2和TGFB3-TGFBR3结合与TRM特异性相互作用，这对于CD8+ T细胞上调CD103以转化为TRM细胞是必不可少的。

接下来，作者又分析了配体、受体及其在不同EGFR状态的两个细胞亚群之间的相互作用。作者发现一些配体-受体对在EGFR阴性组和阳性组中共享，另一些为则出现在EGFR阴性组或阳性组中。关于免疫检查点配体-受体对，与EGFR突变LUAD相比，EGFR野生型的T细胞与其他细胞类型（包括PD-1和PD-L1）之间存在更特异性的相互作用（图7B-D）。IHC结果显示EGFR阳性组中免疫检查点的表达较低，包括PD-1、PD-L1、CTLA4、LAG3、TIM3和CD47（图7E）。值得注意的是，TIGIT在EGFR阳性组中表达更高，尤其是在基质中，而其他免疫检查点的模式则相反（图7E）。这些结果可能会为EGFR突变LUAD的潜在免疫治疗策略提供见解。

结束语

        本文最大的亮点是作者将肺癌中常见的EGFR突变和免疫治疗响应结合起来，通过单细胞数据整合分析，证明了EGFR阴性与免疫治疗响应样本的共同特征。其中，以CD8+ TRM细胞（免疫响应相关）为主线，其他细胞类型围绕这条主线进行详细研究。

参考文献

Yang L, He YT, Dong S, et al. Single-cell transcriptome analysis revealed a suppressive tumor immune microenvironment in EGFR mutant lung adenocarcinoma. J Immunother Cancer. 2022;10(2):e003534. doi:10.1136/jitc-2021-003534