大家好！今天为大家介绍的是英国牛津大学Irina A. Udalova研究团队于2021年9月发表的关于中性粒细胞发育调控的一篇干湿结合文章（IF：25.606）。免疫细胞发育调控机制一直是基础免疫学研究的重要方向，本研究以新思路解析经典问题，涉及大量的数据分析和实验，多处细节值得我们细细推敲，好啦，下面我们就开始学习这篇文章吧！

不同转录因子网络控制中性粒细胞的炎症驱动

中性粒细胞根据其发育阶段、激活状态和组织微环境的不同表现出多种基因表达模式。为明确中性粒细胞调控基因表达的转录因子网络，研究人员对急性炎症过程中中性粒细胞的转录组和染色质分析进行整合。结果显示，骨髓到血液和血液到组织两个过渡阶段中性粒细胞染色质重塑活跃。通过体内外实验联合验证，证实RUNX1和KLF6调节中性粒细胞的成熟，而RELB、IRF5和JUNB驱动中性粒细胞炎性应答，RFX2和RELB促进生存。此外，JUNB表达抑制中性粒细胞的激活，可降低心肌梗死小鼠模型的病理性炎症损伤程度。明确急性炎症过程中中性粒细胞的转录调控机制，可为细胞功能的阶段性治疗提供新靶点。

背景：

中性粒细胞在分化成熟过程中表现出明显的形态变化以及表面受体的阶段性表达模式。细胞进入血液循环后，以多样化形式参与调控炎性应答。目前多项证据显示：中性粒细胞是转录活跃细胞，可通过改变其自身的转录活性调控细胞分化和组织迁移，在多种免疫性疾病和癌症中表现出表型和功能的异质性，但内在调控机制仍不明确。

方法：bulk mRNA-seq+ATAC-seq+细胞实验+小鼠实验

结果：

1，炎性中性粒细胞处于动态转录控制之下

在小鼠的背部注射空气形成囊腔，肉芽组织（腔内膜）形成后，在腔内注射Zymosan（酵母聚糖）刺激中性粒细胞招募和活化，然后对小鼠外周血、腔内膜和腔内渗出物中的中性粒细胞进行表型评估，发现白细胞的数量逐渐升高，IL-1β在腔内膜和腔内渗出物中逐渐升高。表明中性粒细胞在向组织转移过程中发生了活化（图1a）。

从小鼠骨髓、血液、腔内膜和腔内渗出物中分离Ly6G^hiCD11b+中性粒细胞，进行mRNA-seq和ATAC-seq检测，经分析发现在中性粒细胞成熟和炎症级联过程中，趋化因子、细胞因子活性和炎性信号路径基因逐渐上调，而呼吸链复合体、线粒体基质和脂肪酸代谢相关基因则逐渐下调。转录因子的全面分析显示，中性粒细胞离开骨髓后，其合成能力丧失，在外周循环中进行信号转递，最后在炎症部位获得炎性应答表型（图1b-e）。

2，染色质重塑是转录激活的基础

ATAC-seq数据分析显示，骨髓、血液和腔内膜中中性粒细胞的染色质谱存在明显的多样性，说明染色质重塑可能是炎症级联反应过程中转录变化的基础。但在炎症组织到渗出物的过渡期，未观察到进一步的染色质重塑事件，表明在中性粒细胞迁移过程中基因表达不需要转录水平的调控（图2a）。此外，ATAC-seq数据确定了在骨髓到血液和血液到组织这两个过渡点上，增加和减少的差异可及性峰值（differentially accessible Peaks, DAPs）数量相当，说明中性粒细胞染色质重编程存在严格的调控机制（图2b-c）。结合中性粒细胞亚群scRNA-seq数据库结论^[1]，提示中性粒细胞的活化是一个渐进过程，RFX2、KLF6和RUNX1与早期骨髓中性粒细胞向血液的转移以及持续促进成熟有关，而信号依赖性转录因子JUNB、RELB和IRF5则被认为在炎症组织中发挥作用（图2d-f）。

3，骨髓-血液转换过程中的转录因子控制中性粒细胞成熟

为进一步验证转录因子在中性粒细胞中的功能，利用骨髓祖细胞HoxB8模型系统，经CRISPR-Cas9技术选择性敲除转录因子RFX2、KLF6、RUNX1、JUNB、RELB和IRF5，通过中性粒细胞成熟过程中的标志性变化验证其成熟的程度（图3a-c），检测维持中性粒细胞生存相关的转录因子以及代谢情况（图3d-e），并在Lyz2Cre/Cre×Runx1loxP/loxP小鼠模型进行验证，发现在进入组织过程中与中性粒细胞染色质关闭相关的两个基因KLF6和RUNX1，独立参与中性粒细胞的成熟（图3f-g）。而RFX2和RELB与染色质开放有关，维持中性粒细胞生存。

4，RUNX1和KLF6的缺失损害中性粒细胞的招募

未成熟中性粒细胞显示出迁移受损的特性，为明确RUNX1和KLF6对中性粒细胞迁移功能的调控作用，首先采用Boyden室迁移试验证实Runx1-/-和KLF6-/-中性粒细胞的迁移明显减少（图4a）。为评估RUNX1和KLF6对中性粒细胞成熟和迁移的转录程序影响，对Runx1-/-和KLF6-/-和Hoxb8中性粒细胞进行多时间点mRNA-seq分析，发现RUNX1和KLF6控制大量白细胞迁移相关基因。为探究RUNX1和KLF6在体内中性粒细胞招募中的作用，将CellTracker Far Red标记法跟踪Runx1-/-，KLF6-/-和Rfx2-/- HoxB8中性粒细胞的转移情况，发现RELB和RFX2的缺乏导致中性粒细胞在炎症部位浸润减少且生存受限（图4b-c）。同时，RUNX1缺陷小鼠炎症部位的成熟中性粒细胞数量明显低与野生鼠（图4d）。由此认为，KLF6和RUNX1处于中性粒细胞分化级联的开端，可独立控制多个关键程序，包括中性粒细胞的分化、迁移、颗粒形成和代谢。

5，RELB、IRF5和JUNB控制中性粒细胞的活化和效应功能

为明确染色质开放有关的转录因子是否调节中性粒细胞活化，研究者对RELB, IRF5, JUNB敲除的HoxB8中性粒细胞进行mRNA-seq检测分析，然后通过ATAC-Seq分析，在开放染色质区域搜索共同转录因子结合位点相近的基因与mRNA-seq分析的DEGs比较，发现血液到组织过渡阶段激活的转录因子中，JUNB对中性粒细胞效应功能的影响最明显，而IRF5和RELB的作用稍弱（图5a-c）。IRF5和JUNB缺陷影响中性粒细胞的吞噬能力（图5d）。而RELB和JUNB对产生ROS（图5e）、杀灭细菌（图5f）以及胞外凹陷（NET）的形成（图5g）非常关键。

6，RELB、IRF5和JUNB控制炎症介质的表达

HoxB8中性粒细胞和小鼠中性粒细胞的RELB、IRF5和JUNB缺陷直接影响影响细胞因子和趋化因子的表达。即IRF5、RELB和JUNB在体外和体内炎症部位能有效调节炎症细胞因子的产生（图6a-f）。

为证明干扰中性粒细胞激活可抑制体内的病理性炎症，采用中性粒细胞依赖性的左前降支冠状动脉缺血再灌注诱发的急性心肌梗死（AMI）小鼠模型进行验证，发现敲除中性粒细胞JUNB基因的小鼠心肌梗死面积明显减少（图7a-d），而中性粒细胞转移到炎症部位不受JUNB缺陷影响（图4c），但IL-1β和细胞内ROS（图7e-g）的水平均下降。说明中性粒细胞特异性抑制JUNB可减缓中性粒细胞驱动的炎症期间组织病理性破坏。

小结：

本研究通过系统描述中性粒细胞在不同的发育阶段、激活状态下显示出不同的基因表达谱和转录调控模式，并阐明炎性应答功能的分子调节机制。调控中性粒细胞的转录因子激活状态有可能成为阶段性控制疾病进展的潜在治疗策略。

参考文献：

[1] Xie, X.,Q. Shi. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection[J], 2020, 21(9): 1119-1133.