3步？纯生信？就这也能发6+？

哈喽，大家好，今天小编向大家分享一篇发表在Journal of Cellular Physiology杂志（IF 6.384/Q2）上的纯生信文章，为了保持神秘感，小编先不透露这篇文章的主要研究内容哈，不过友情提醒“老”生信人扶好下巴，小心惊掉哦~同时呢，小编也想和那些没有生信基础，还在观望状态准备上手生信分析的小伙伴说，get生信分析技能，发SCI不是梦！言归正传，上干货！

背景介绍

自身免疫性肝炎(AIH)是一种以慢性肝脏炎症、界面性肝炎、血清免疫球蛋白 γ升高和非器官特异性自身抗体产生为特征的免疫介导的肝细胞损伤性疾病。非特异性免疫抑制是目前的标准治疗方法。AIH的一个显著特征是肝脏中存在T辅助细胞1(Th1)产生的干扰素- γ(IFN-γ)。一些研究表明 BALB/c 具有纯合 Tgfb1 缺陷的小鼠自发地迅速发展为 Th1 介导的 IFN-γ 依赖性坏死性炎症性肝病，从而建立了暴发性 AIH 模型。

研究方法

1.数据来源

GSE9892：GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)

WT：野生型小鼠

Tko：Tgfb1缺失的小鼠

ITko：Tgfb1和Ifng缺失的小鼠

一个样本取自一只小鼠，每个基因型包含三只小鼠。

(小编理解：“ko”为knockout缩写，T为Tgfb1缩写，IT为Tgfb1和Ifng缩写)

 2.分析流程

1)差异表达基因的鉴定：GEO2R在线工具，p <0 .05和|倍数变化|≥1.5被定义为差异表达基因(DEGs)

2)功能富集分析：使用Cytoscape与插件CluGO(版本2.5.4)

3)免疫细胞浸润的评估：CIBERSORT在线网站

结果展示

Part 1. 哼！谁还不会基因差异表达分析呢？

图1a 小提琴图展示了这9只小鼠所有基因的表达分布。

图1b 展示了这三种基因型两两比较后筛选出的上调DEGs和下调DEGs。

图1c-e 可视化每组比较的前50个DEGs。

Part 2. 这？不就是最简单的功能富集分析？

小编绞尽脑汁，思前想后，终于get到了作者的思维逻辑：“总-分”

第一个“总-分”结构

作者通过三种基因型两两比较后筛选出了一堆儿DEGs，生信分析的套路不就是先筛选出一堆儿的差异基因，然后通过一系列的手段和方法，不断缩小选择范围，从而获得几十个甚至几个自己“最中意”的目标基因吗吗？其中最常用的一种方法就是“取交集—Veen图”，聪明如小编的作者同样采取了这种做法~

1.1“总”：三种基因型共同DEGs的功能富集分析

图2a 展示了三种基因型两两比较后获得的516个共同DEGs。

图2b 通过和弦图展示了每组比较之间DEGs的相互关系。

图2c GO功能富集分析：这些DEGs在生物过程中显著富集，包括对干扰素-γ的响应和先天免疫反应的正向调节。相互关系分析表明，生物过程可分为几组，其中细胞对细胞因子刺激的反应、免疫反应的调节和先天免疫反应是富集的前三组。

图2d KEGG信号通路富集分析：白细胞介素-1信号，免疫应答蛋白的磺酰化，通过ZBP1的放射免疫沉淀介导的核因子κB活化是最显著富集的途径之一，相关性分析显示CD3和TCR zeta链的磷酸化、免疫系统、磷脂在吞噬作用中的作用、白细胞介素信号、葡萄糖代谢、与趋化因子受体结合的趋化因子是显著富集的途径。

1.2“分”：与WT组相比，Tko组DEGs的功能富集分析

图3a Tko组中表达上调(2451个)和表达下调(2894个)的DEGs。

图3b 上调基因的GO功能富集分析：刺激反应的正调控、白细胞活化、免疫系统过程的（正)调控、定位调节和先天性免疫反应是最丰富的生物过程。

图3c 下调基因的GO功能富集分析：富集的生物过程主要分为代谢过程，包括有机酸代谢过程、脂质代谢过程和辅助因子代谢过程。

图3d 上调基因的KEGG信号通路富集分析：PD-1信号转导、Toll样受体级联、免疫系统中的细胞因子信号转导、干扰素-γ信号转导和基因表达/转录是分类最多的通路。

图3e 下调基因的KEGG信号通路富集分析：大多富集在细胞周期、免疫系统、脂类/甾体代谢和生物氧化等途径。

1.3“分”：与WT组相比，ITko组DEGs的功能富集分析

图4a ITko组中表达上调(2744个)和表达下调(1929个)的DEGs。

图4b 上调基因的GO功能富集分析：T细胞活化、细胞过程的正向调控、白细胞活化/迁移、细胞因子产生的调控、免疫系统过程的调控归为最重要的生物过程。

图4c 下调基因的GO功能富集分析：富集的生物过程主要分为代谢过程，包括有机酸代谢过程、脂质代谢过程和辅助因子代谢过程。

图4d 上调基因的KEGG信号通路富集分析：大多富集在Rho GTP酶信号传递、免疫系统、Fc-γ受体依赖的吞噬作用和免疫系统中细胞因子信号传递等通路中。

图4e 下调基因的KEGG信号通路富集分析：在脂质/甾体/氨基酸的代谢、化合物的一期功能化、生物氧化剂和免疫系统等途径中显著富集。

第二个“总-分”结构

一顿操作猛如虎，细心的读者就能发现，分析了那么多，却还没有真正进入正题，那正题是啥呢？不就是“自身免疫性肝炎--AIH”嘛！所以接下来自然而然的就要围绕主题开展分析了，果不其然，第二个“总-分”结构踏着轻盈的步伐朝我们走来了~

2.1“总”：与AIH缓解相关DEGs的功能富集分析

图5a 与AIH 缓解相关的下调DEGs：Tko vs WT获得2451个上调基因，ITko vs Tko获得1004个下调基因，取交集得472个共同DEGs。

图5b 与AIH 缓解相关的上调DEGs：Tko vs WT获得2624个下调基因，ITko vs Tko获得1911个上调基因，取交集得586个共同DEGs。

图5c 上调基因的GO功能富集分析：这些基因在免疫反应调控方面显著富集，可分为对其他机体的反应、防御反应的调控、免疫系统过程/免疫反应的调控和对细胞因子的反应/调控等。

图5d上调基因的KEGG信号通路富集分析：这些基因主要富集在免疫系统通路中，显著富集的组别包括干扰素信号转导、IFN刺激基因的抗病毒机制、(适应性)免疫系统和葡萄糖代谢。

图5e 下调基因的GO功能富集分析：细胞-细胞信号转导、管发育和神经系统发育最显著富集

图5f 下调基因的KEGG信号通路富集分析：细胞外基质组织、含TSR域蛋白的O-糖基化和跨化学突触的传递是富集度最高的途径。

2.2“分”：Tko小鼠和ITko小鼠特异性上调基因分析

图6a Tko小鼠和ITko小鼠特异性上调DEGs：Tko vs WT获得1141个上调基因，ITko vs WT获得1434个上调基因。

图6b Tko小鼠上调DEGs的GO功能富集分析：显著富集在对细胞因子的反应、解剖结构形态发生、防御反应、免疫系统过程的调控和多细胞机体过程的调控等。

图6c Tko小鼠上调DEGs的KEGG信号通路富集分析：总富集的通路主要可以归纳为免疫系统、免疫系统中细胞因子信号转导、白细胞介素的信号转导、止血、趋化因子受体结合趋化因子。

图6d ITko小鼠上调DEGs的GO功能富集分析：这些基因大多参与的途径主要可归纳为（有丝分裂）细胞周期过程、有丝分裂核分裂的负调控、（微管）细胞骨架组织、蛋白质定位到染色体、DNA复制独立的核小体组装。

图6e ITko小鼠上调DEGs的KEGG信号通路富集分析：基因显著富集在包括细胞周期、有丝分裂前分裂、核包膜分解、驱动蛋白和Emi 1的磷酸化等通路组中。

2.3“分”：Tko小鼠和ITko小鼠特异性下调基因分析

图7a Tko小鼠和ITko小鼠特异性下调DEGs：Tko vs WT获得1713个下调基因，ITko vs WT获得748个下调基因。

图7b ITko小鼠下调DEGs的GO功能富集分析：大多富集在多细胞生物体发育、细胞通信调节、细胞大分子代谢过程和突触组织等。

图7c ITko小鼠下调DEGs的KEGG信号通路富集分析：这些基因在免疫系统、GPCR信号传递、线粒体翻译终止、磷酸肌苷-3激活的AKT信号传递和细胞对应激的反应等通路组中显著富集。

图7d Tko小鼠下调DEGs的GO功能富集分析：这些基因显著富集在有机酸/羧酸/脂质代谢过程、细胞对化学刺激的反应以及参与与共生体相互作用的宿主细胞的自噬。

图7e Tko小鼠下调DEGs的KEGG信号通路富集分析：总富集通路主要可分为氨基酸及衍生物代谢、Toll样受体级联、钼辅基生物合成、COPII介导的囊泡运输和糖胺聚糖代谢等。

Part 3. 嗐！最终还是避免不了蹭热点：免疫细胞浸润分析

看了前两部分的分析，你是不是和小编一样心中充满大写的不服气，就这？也能发6+？说来说去，看似分析了很多内容，其实不就是选择不同的对照组，重复的进行差异表达基因(DEGs)和GO/KEGG富集分析吗？技术含量趋近0。不过，在文章的末尾，终于看到了已经不算是热点的“热点”了[笑哭]。

我们姑且信了作者所说的，为了深入了解不同条件下免疫细胞的组成，才进行了免疫细胞浸润分析，用到的还是在线的CIBERSORT分析工具[笑哭]。

免疫细胞丰度如图8a所示，Tko组的T细胞、巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞增加，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、浆细胞和B细胞显著减少。与Tko组相比，ITko组巨噬细胞和NK细胞减少，T细胞、嗜酸性粒细胞和浆细胞增加。又如图8b所示，CD4 T细胞是T细胞的主要类型。尽管有些变化并不显著，但观察到CD4 T细胞和CD8 T细胞的免疫状态从幼稚转变为记忆的趋势（图8c）。此外，还观察到辅助性T细胞的亚群转移和巨噬细胞的表型转移（图8d）。

结语

至此，全文结束。额…说实话，小编在完整阅读这篇文献之前，还想着6+的纯生信，纯生信哎！没有实验验证，总得有新奇的分析思路或者复杂的分析方法吧？读完以后才发觉，也不过尔尔哈哈哈哈！所以说呢，咱们生信人就要有生信人的样子，不怕没思路，不怕技术不到家，只要有想法，就要去尝试，哪怕只是掌握了最简单的分析方法，努力去做，发SCI还不是信手拈来的事情？

调侃归调侃哈哈，作者利用这么简单的分析方法就能够发IF 6+的SCI 论文，还是有其值得学习的地方的，我们正常情况下都会选择人类来源的数据，而作者独辟蹊径，选择AIH小鼠模型的微阵列数据，这也为我们以后的数据选择提供了参考。其次，其研究在某些程度上也是具有重要意义的，作者全面揭示了该疾病所涉及的潜在生物学过程。发现AIH的发展与显著增加的免疫反应和急剧抑制的代谢过程有关。通过估计免疫细胞的浸润，发现了几种类型的免疫细胞的失调，为理解AIH的发展提供了一个新的视角，这将有利于制定针对该病的有效治疗策略。

参考文献:Yu K, Yang J, Xie W, Wu F, Wang M, Li N. Integrated bioinformatic analysis revealed biological processes and immune cells implicated in autoimmune hepatitis. J Cell Physiol. 2021 Jul;236(7):5411-5420. doi: 10.1002/jcp.30246. Epub 2021 Feb 17. PMID: 33595095.