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文章简介：
这篇文章发表在期刊: Embo Reports，期刊在最近一年的影响因子: 8.807比上一年增加了 1.31。这篇文章用 snRNA-seq 和 scRNA-seq 数据，构建人脊髓不同发育时期的单细胞转录组图谱，得到完整的神经元数据集，揭示了不同时期人脊髓神经细胞的发育时期特性和遗传异质性；鉴定了不同发育时期转录组特征，同时揭示了不同发育时期神经元的构成变化。
背景知识：
脊髓是一种高度组织化的组织，由三种不同的神经细胞组成：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。同时，脊髓是外周系统与大脑间信号传递的桥梁。脊髓背角介导着外周感受信号，而腹侧对于运动功能的执行至关重要，同时也是低级反射的中枢。作为一种高度有序的中枢组织，脊髓由多种不同的细胞类型有序发育形成。虽然脊髓的发育在啮齿类动物中已进行了一系列的研究，但对人类脊髓发育过程了解较少。
一些单细胞测序（scRNA-seq）研究脊髓发育已经在模型系统中进行；然而，由于这些研究大多集中于神经发生，胶质细胞发育的单细胞转录组学信息仍然缺乏，尤其是星形胶质细胞。胶质细胞是神经系统的中枢组成部分。最近的研究指出胶质细胞在发育和成熟中枢神经系统中的作用越来越广泛。单细胞分析为人类胶质细胞的多样性和发展提供更多的信息。此外，与模式脊椎动物相比，人类胚胎的妊娠期较长，神经发生和胶质发生的时间较长。这种延长的发育有利于分析神经细胞亚型及其在成熟过程中的过渡状态。基于此，对发育中的人类脊髓进行了高通量单细胞核 RNA 测序（snRNA-seq）和单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）研究。
结果解读：
作者从GW7到GW23获取了脊髓样本。GW是从女性最后一次月经期的第一天开始测量的。对样品进行snRNA-seq和/或scRNA-seq处理(Fig 1A )。通过UMAP将数据投射到二维，并基于差异表达基因(DEG)和基因本体论(GO)分析确定主要细胞类型。一共鉴定出八大类：神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞(包括顶板和底板细胞)、神经前体细胞、小胶质细胞、脑膜细胞和血管细胞(Fig 1B )。
神经干细胞具有增殖和分化为神经细胞和胶质细胞的能力。作者研究了个体样本内的分化轨迹(Fig 1C)。在GW14后，NPC簇失去了与神经元群的联系，但与星形胶质细胞和少突胶质细胞簇的联系仍然存在。在GW22之后，大多数分裂的NPC倾向于与少突胶质细胞群相连(Fig 1C)。免疫荧光分析还显示，RBFOX3阳性神经细胞是GW7脊髓的主要细胞类型。从GW10开始，GFAP阳性星形胶质细胞呈放射状胶质细胞形态，这有助于胶质细胞迁移。脊髓在GW23左右达到成熟形态(Fig 1D)。总的来说，这些结果反映了胶质细胞群体在发育过程中的动态产生。
为了深入了解神经元的分化过程，作者对从GW7到GW11的基于NPC和神经细胞的神经元谱系进行了亚群分析。通过表达螺旋-环-螺旋和成对的盒转录因子如HES6、DLL1和PAX3来鉴定神经前体细胞。兴奋性神经元(EXC)、抑制性神经元(INH)和运动神经元(MN)分别通过SLC17A6、GAD1和MNX1的表达来区分。热图可视化显示了簇中排名前10位的差异基因(Fig 2A)。差异表达数据的GO富集分析表明，神经元前体细胞富集在翻译、起始和膜靶向蛋白上，而未成熟背部神经元富集在神经元分化和突触信号上(Fig 2B)。作者观察到，有丝分裂神经元前体簇强烈表达了背侧神经前体基因PAX3，而腹侧基因NKX6-2在该人群中的表达较少。免疫组织化学染色证实GW7后脑室区背侧充满神经前体细胞(Fig 2C)。接下来，作者确定每个发育时间点每个细胞群体的相对比例，以估计发育趋势(Fig 2D)。虽然在GW7有腹侧神经元发育的迹象，但作者的数据表明背侧神经元的发育是这一时期的主要事件(GW7-GW11)。对GW10 (Fig 2E)的分析还表明，神经元分化途径富集到神经元转录调控因子，如POU4F1和TLX3。
为了评价神经细胞的多样性并剖析其在人脊髓中的发育，作者整合了从GW7到GW23的神经细胞数据集。整合导致了神经细胞类型的细胞转录多样性(Fig 3A和C)。作者发现星形胶质细胞(0、3、7和14群，包括早期发育阶段的祖细胞)在GW20达到最高比例(33.5%)，少突胶质细胞(4、6、8和11群)从GW8开始增加，到GW23达到51% (Fig 3B)，DEGs的GO富集分析表明，第0簇富含神经前体细胞增殖和胶质细胞分化相关基因，第3簇富含轴突发生和神经元迁移相关基因，第7簇富含纤毛组装和纤毛组织，第14簇富含胶质细胞发育和星形胶质细胞分化相关基因(Fig 3D)。
作者注意到第14和0簇是由所有妊娠阶段(GW7-GW23)的细胞组成的，而第3和第7簇是由只有在GW11之后才出现的细胞组成的。这种细胞组成的差异表明：14和0簇含有胶质分化前出现的祖细胞。对来自GW7的14和0簇的GO富集分析表明，14簇富含与脊髓发育和神经元命运commitment (Fig 4A and B)。第0簇富含胶质细胞命运commitment基因(如DAAM2、FAM189A2和ID4)，并在GW7出现分化停滞状态(Fig 4A and B)。因此，作者的结果表明，在GW7，第14簇细胞是神经祖细胞，而第0簇代表静止的胶质前体细胞。进一步分析表明，第14簇的细胞在GW11之后逐渐获得星形胶质细胞的表达谱。为了说明这一转换过程，作者构建了一个显示细胞状态转换过程的单细胞轨迹。男性标本从神经发生后期到胶质发生阶段的细胞按发育阶段形成连续的直线轨迹，代表了EGFR+胶质细胞的过渡过程(Fig 4C)。结果显示，DLL1在GW18后表达下降，随后保持在相对较低的水平。与此同时，在GW14之后，作者观察到调节神经前体分化和新生神经元存活的MIAT表达的减少。星形胶质细胞相关基因FAM189A2、GFAP和AQP4的表达从神经发生晚期开始持续增加(GW11) (Figs 4D)。轨迹分析结果与综合分析结果一致，表明EGFR+细胞簇(共表达EGFR、DLL1和HES6)主要与星形胶质细胞谱系有关。接下来，作者根据潜在的受体-配体对相互作用来预测不同类型神经细胞之间的细胞间通讯网络。这一分析表明EGFR+细胞与其他类型的胶质细胞(即星形胶质细胞、室管膜细胞、NPC、OPC和少突胶质细胞)之间的相互作用是通过Delta-Notch配体受体和EGFR信号通路实现的(Fig 4E)。
为了进一步研究EGFR表达的细胞，作者对GW7到GW23的脊髓样本进行了免疫染色。作者发现EGFR+细胞在GW7的丰度很低，但在GW11左右急剧增加。此外，随着时间的推移，这些细胞的形态也发生了变化。作者还注意到EGFR+细胞的分布具有位置特异性(Fig 5A和B)。在GW11时，在脑室带的背侧和腹侧都观察到了大量的EGFR+细胞。背侧EGFR+细胞具有典型的放射状胶质细胞形态，包括从腹部区延伸到软膜表面的单个细小突起，可以用GFAP进行双重标记(Fig 5D)。同时，在腹侧EGFR+细胞群中观察到EGFR和OLIG2的共定位(Figs 6A and B)，与作者的测序数据一致。在GW11scRNA-seq数据中，EGFR+簇表现出明显的表达模式：大多数EGFR+PAX3+细胞不表达OLIG2，而在PAX3阴性EGFR+细胞中检测到OLIG2表达(Fig 5C)。作者观察到表皮生长因子受体与星形胶质细胞系标记物SOX9的共表达和少突胶质细胞系标记物OLIG2。表明EGFR+胶质细胞是一种既可分化为星形胶质细胞又可分化为少突胶质细胞的过渡状态(Fig 6C and D)。综上所述，作者的研究结果表明，一群表达EGFR的过渡性胶质细胞起源于神经元前体细胞，并通过中间阶段逐渐转化为星形胶质细胞和少突胶质细胞系。这些细胞可以通过受体-配体的相互作用来调节胶质形成。值得注意的是，作者的结果表明，在发育过程中，表达EGFR的过渡性胶质细胞以位置特异性的方式分布，背侧EGFR+细胞主要集中在背角区域。
全文小结：
总体而言，作者已经勾勒出人类脊髓神经发育的图景，涵盖了从神经元产生到星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的时期。不同发育阶段的神经细胞类型的转录组特征是在单细胞分辨率下定义的。作者的研究提供了对人类脊髓发育的基本见解，可能有助于实现细胞治疗方法来治疗脊髓疾病。
参考文献：Zhang, Q., Wu, X., Fan, Y., Jiang, P., Zhao, Y., Yang, Y., . . . Dai, J. (2021). Single-cell analysis reveals dynamic changes of neural cells in developing human spinal cord. EMBO Rep, 22(11), e52728. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/34605607. doi:10.15252/embr.202152728
