早晨好呀，小编与您一起开启元气满满的一天！肠道菌群与肿瘤治疗的相关研究蒸蒸日上，而肠道菌群是如何调控肿瘤微环境中免疫细胞异质性而影响药物应答呢？近期《Cell》杂志上发表一篇名为“Microbiota triggers STING-type I IFN-dependent monocyte reprogramming of the tumor microenvironment”的文章，该研究思路逻辑清晰，环环相扣，巧妙的地挖掘临床数据验证基础研究结论，让我们一起来抽丝剥茧，揭晓答案！

肠道菌群触发肿瘤微环境中STING-IFN-Ⅰ依赖的单核细胞重编程

背景：

肠道菌群可影响抗肿瘤免疫功能，控制肿瘤细胞自发生长以及调控化学治疗和免疫治疗的应答效应。免疫细胞在肿瘤微环境（TME）中扮演关键角色，其浸润类别和比例对临床治疗效果有重要预测价值。单核吞噬细胞系统（MPs）作为TME的重要组成部分，存在高度的异质性和可塑性，包括单核细胞 [Mo]、巨噬细胞 [Macs] 和树突状细胞 [DCs]，Mo可分化为DCs诱导抗肿瘤反应，也可分化为Macs促进肿瘤的免疫抑制和疾病进展。肠道菌群组成与个体对免疫检查点阻断（ICB）的反应之间存在关联，但菌群能否调节TME中MPs的异质性以及涉及的信号传导路径有待研究。

本文的研究者发现缺乏微生物群会使TME向促肿瘤性Macs倾斜。微生物群衍生的STING（stimulator of interferon genes）激动剂可诱导瘤内单核细胞产生I型干扰素（IFN-I），从而调节巨噬细胞极化和NK-DC轴。采用高纤维饮食调节肠道菌群可触发瘤内IFN-I-NK-DC信号轴，并提高免疫检查点阻断（ICB）的疗效，表明化疗药物反应者（R）与非反应者（NR）之间的免疫细胞构成差异可通过粪便菌移植转移来实现。这项研究揭示了微生物群和TME之间的调控新机制，有望改善癌症治疗预后。

结果：

1，菌群缺失诱导肿瘤微环境中Macs增加，而Mo和DCs减少

为探究菌群是否参与塑造TME中MPs构成，首先将EL4淋巴瘤肿瘤植入SPF小鼠和无菌饲养GF小鼠，通过NanoString分析，基因组富集分析（GSEA）结合免疫学基因组（ImmGen）数据，发现在SPF鼠和GF鼠的肿瘤浸润性MPs之间存在显著分布差异（图1A-B）。对肿瘤组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），证实SPF鼠的TME中以DCs为主，而GF鼠更倾向分化为促肿瘤性Macs细胞（图1C-H）。GSEA结果显示IFN-α应答是Macs和DCs细胞的最主要途径。SPF的MPs与抗肿瘤有关，而GF的MPs与免疫调节和抗炎功能有关（图1I-J）。菌群缺乏会导致肿瘤内IFN-Ⅰ信号传导受损，MPs更倾向于Macs浸润，而Mo和DCs比例减少。

2，菌群调控肿瘤IFN-I-NK细胞轴

在TME中，GF鼠的Mo和DCs的数量显著低于SPF，使用广谱抗生素（ABX）抑制SPF鼠的菌群会出现类似的表型（图2A-B）。缺乏菌群的小鼠存在TME特异性而非全身性DCs生成障碍（图2C-D）。说明在菌群缺失的情况下，Mo和DCs的数量均减少（图2E-G）。因此，尽管以菌群为导向的信号在生理水平不足以控制自发肿瘤生长，但对于调控MPs构成和获得良好的抗肿瘤治疗应答至关重要。

为了解菌群如何调控TME中的MPs，对可能影响MPs功能的瘤内细胞因子和趋化因子进行检测。发现在GF鼠的EL4肿瘤中，与Mo和DCs的募集、维持和功能相关的蛋白质以及IFN-I在蛋白质（IFNa）和mRNA（Ifnb1）均降低（图3A-B）。推测菌群可以调节TME中IFN-I的产生，利于抗肿瘤免疫应答。为明确在缺乏菌群的情况下，缺乏IFN-I信号而导致的相同TME重塑是否影响治疗应答，采用化疗药物奥沙利铂（oxa，需要菌群信号和髓样细胞发挥疗效）作用于Ifnar1^-/-鼠，发现Ifnar1^-/-鼠显示出对oxa的反应类似于ABX或GF鼠（图3D），证实IFN-I信号是oxa应答所必需。STING是IFN-I产生的一个主要调节因子，在化疗过程中发挥重要作用。STING的缺乏（Tmem173^-/-）则引起oxa的应答受损，与Ifnar1或菌群信号的缺失相似（图3E）。说明菌群对抗肿瘤治疗效果的影响至少部分是通过IFN-I诱导产生的。

蛋白质数据分析显示，GF鼠和Ifnar1^-/-肿瘤中对NK细胞募集和激活至关重要的IFN诱导蛋白数量和NK细胞比例显著降低，GF鼠肿瘤中Xcl1表达降低（图3F-I）。比较来自SPF与GF鼠肿瘤的NK细胞的转录谱，发现SPF的NK细胞具有活化表型，编码效应蛋白和已知调节NK细胞功能的基因表达较高。相反，来自GF的NK细胞表达更高水平的转化生长因子β诱导蛋白（Tgfbi）基因，IFNg也显著减少（图3J）。结果显示：菌群诱导TME中的IFN-I信号引起NK细胞的有效募集和激活，NK细胞通过募集DC触发正反馈路径以促进抗肿瘤免疫应答。

3，STING激动剂c-di-AMP刺激肿瘤IFN-I-NK轴并重编程MPs

STING介导的IFN-I信号可以增强NK细胞的抗肿瘤作用。推断菌群衍生的STING激动剂，如环状二核苷酸（CDNs）将能够调节TME中的IFN-I-NK-DC轴。采用细菌CDN环状二腺苷单磷酸酯（c-di-AMP [cdAMP]）体外刺激肿瘤浸润细胞，发现cdAMP诱导下的TME细胞是IFN-I的主要来源（图3K）。cdAMP诱导IFN-I产生引起Xcl1和Ccl5的增加表达（图3L）。有趣的是，对SPF或GF鼠肿瘤中MPs的NanoString分析显示GF肿瘤的Mo产生Ifnb1的能力受损（图3M），可解释IFN-I蛋白的减少、NK细胞的功能障碍。为挽救GF鼠TME的IFN-I信号缺陷，模拟菌群衍生物的潜在系统性效应，发现GF动物在cdAMP作用下，肿瘤内的IFN-I基因水平增加并恢复Mo和DCs的浸润（图3N-O）。结果表明：菌群衍生产物，如STING激动剂cdAMP通过IFN-I调节TME中先天免疫细胞的相互作用和抗肿瘤应答反应。

4，高纤维饮食可调节菌群，诱导IFN-I，增加DCs，改善抗肿瘤应答

肠道菌群组成与癌症治疗效应有关。SPF小鼠在EL4肿瘤植入前喂饲高纤维饮食（FD）或ABX来调控小鼠肠道菌。发现与对照饮食的小鼠相比，FD小鼠的EL4肿瘤的发生率和总DCs的绝对数量增加，且出现较低的癌症风险和自发肿瘤生长抑制状态（图4A-C）。MC38模型证实FD可重塑肿瘤内MPs构成，增加DCs和Mo，减少Macs（图4D-H）。更重要的是FD显著增强抗PD-1和抗PD-L1治疗的疗效（图4I-J）。结果：调控菌群可以改变TME的构成，特别是DCs比例，进而调控抗肿瘤应答能力。

5，Akkermansia muciniphila可触发TME中IFN-I-NK-DC轴

为探索IFN-I-NK细胞轴在FD诱导TME重塑中的作用，将FD饲养的小鼠粪便移植（FMT）到GF动物体内。发现FD移植后的GF鼠肿瘤中IFN-I基因水平更高，表达Ifnb1的Mo比例更高，NK细胞的Xcl1表达增加（图5A）。证实FD小鼠菌群通过IFN-I重塑TME，调节DCs含量增加和抗肿瘤应答能力。

为评估由FD引起的菌群的变化，对不同地区繁育小鼠进行FD饲喂后进行粪便16S rRNA测序，发现FD饲喂足以诱导类似的肠道菌群组成（图5B）。而菌群中α-多样性减少，phyla Verrucomicrobia与Proteobacteria丰度增加，Firmicutes减少（图5C）。然后构建transkingdom网络预测，网络由13个细菌节点和4个表型节点组成。Akkermansia与cDC浸润呈正相关，与肿瘤负荷呈负相关，表明Akkermansia与肿瘤控制有关（图5D）。

为探索单一类型微生物是否足以诱发TME中的免疫变化，利用双位数的间性中心（BiBC）分析衡量网络中单个节点影响，发现Akkermansia具有最高的BiBC得分（图5E），成为介导FD调节的DCs和肿瘤生长表型的最佳候选菌。为测试Akkermansia的预测调节作用，在肿瘤植入前，将Akkermansia muciniphila (Akk) 单克隆鼠与GF小鼠相比，发现DCs明显增加，pro/antitumor中Macs比率明显降低，抑制肿瘤生长（图5F-G）。

为验证Akk利于重塑TME是通过STING-IFN-I路径实现。采用液相色谱-质谱法（LC-MS）测量细菌产生的CDNs（cdAMP，c-di-guanosine monophosphate [cdGMP]和c-GAMP），发现Akk以产生cdAMP为主（图5H）。分析来自SPF、GF或GF+Akk的小鼠肠道内容物，发现SPF小鼠可产生三种CDNs，GF小鼠中未检测到，而Akk可诱导GF小鼠生成cdAMP（图5I），证实Akk在体内主要诱导生成cdAMP。

为检测cdAMP的生物活性及其诱导IFN-I的潜力，将热灭活Akk或其培养上清与STING-IRF3细胞在有或无STING抑制剂的情况下共同培养，两者均可诱导STING介导的IRF3激活（图5J）。然后探索Akk是否也能调节体内IFN-I-NK细胞轴，发现GF+Akk的TME中产生Ifnb1的Mo和NK细胞的Xcl1表达增加（图5K）。证实Akk的存在与TME中IFN-I-NK-DC轴的激活促进抗肿瘤应答之间的直接联系。

6，瘤内Mo-IFN-I-NK-DC相互作用与黑色素瘤患者对ICB的反应相关

菌群如何影响癌症患者对ICB药物的应答？为探究这个问题，通过重新分析经ICB治疗黑色素瘤患者队列的RNA-seq数据^[1]，发现IFN-I基因与Mo、NK细胞和DCs之间存在显著的正相关关系（图6A）。在缺乏菌群的小鼠和无应答者（NR）肿瘤中，抑制肿瘤的MPs细胞类型和细胞因子/趋化因子的基因特征明显降低（图6B）。此外，重分析在接受ICB治疗的黑色素瘤患者的验证队列中观察到类似的结论^[2]，即Mo、IFN-I、趋化因子、DCs、CDC1和IL15RA基因高表达与治疗后总体生存率的提高显著相关，而趋化因子产生与NK细胞功能有关（图6C-D）。在ICB应答者（R）和NR的TME中观察到的治疗效果差异，支持菌群通过重编程TME先天免疫细胞影响个体对ICB的应答反应。

7，菌群调控IFN-I和TME中的MPs细胞构成，以促进ICB治疗作用

为了验证在R和NR个体的TME免疫成分差异与菌群之间调控关系，对来自ICB治疗的3个R和个NR个体进行FMT，即粪便分别移植给GF鼠（图7A）。接受R-FMT的GF鼠TME中的Mo获得刺激性表型，与SPF相似。相反，接受NR-FMT的GF鼠的MPs向Macs倾斜（图7B-C），类似于GF。NR-FMT小鼠的肿瘤内DCs和Mo也显著减少，促进/抗肿瘤Macs比率增加，NK细胞有减少趋势（图7D）。此外，NR-FMT肿瘤降低Ifnb1表达并导致NR-FMT小鼠的肿瘤生长抑制性差（图7E-F）。证明菌群、肿瘤内IFN-I和ICB反应之间存在因果调控关系。

最后从临床角度验证调控关系，利用一项I期临床试验中，患有抗PD-1难治性转移性黑色素瘤患者接受FMT后获得有效应答再次接受抗PD-1治疗，对治疗有效人群（trial-R）和无效人群（trial-NR）肿瘤的RNA-seq数据^[3]重分析，发现IFN-α应答是FMT后上调的首要途径之一（图7G）。此外，Mo、IFN-I、NK细胞、趋化因子、DCs、cDC1s、IL-15/IL-15RA和CD8 T细胞的基因特征在FMT后的trial-R组中均出现升高（图7H）。相对于基线水平（FMT前），以上基因特征在FMT后试验trial-R组肿瘤中有所增加，但在trial-NR组中保持不变（图7I）。说明菌群、瘤内IFN-I-NK-DC轴，以及癌症患者对ICB的反应之间存在明显的因果调控关系。

通过对以上内容的学习，主要结论归纳为以下几点：

1，菌群产生的STING激动剂（cdAMP）诱导TME中Mo产生IFN-I，触发抗肿瘤作用。

2，Mo调节NK细胞的招募和激活以及随后的NK与DCs间的调控关系。

3，破坏菌群导致Mo/IFN-I/NK/DC信号传导异常，Mo分化为促肿瘤Macs。

4，FD可调节菌群产生cdAMP，触发IFN-I途径并改善抗肿瘤应答反应。

5，移植来自ICB 应答个体的菌群可诱导肿瘤内IFN-I，重塑TME，利于ICB应答。

参考文献：

[1] Helmink, B.A., S.M. Reddy, J. Gao, et al. B cells and tertiary lymphoid structures promote immunotherapy response[J]. Nature, 2020, 577(7791): 549-555.

[2] Liu, D.,B. Schilling. Integrative molecular and clinical modeling of clinical outcomes to PD1 blockade in patients with metastatic melanoma[J], 2019, 25(12): 1916-1927.

[3] Baruch, E.N.,I. Youngster. Fecal microbiota transplant promotes response in immunotherapy-refractory melanoma patients[J], 2021, 371(6529): 602-609.