Cell重磅|全面多组学鉴定新型胰腺癌治疗靶点及早期诊断标志物

哈喽，大家好，不知大家的国庆小长假过得怎么样呢？有没有出去尽情high呢？话说回来，小编的假期可以说是过得相当有意义呢，小编啊可是一个勤奋刻苦努力上进的好孩纸，这不放假期间也不忘读文献，可谓是受益匪浅[骄傲脸]。独乐乐不如众乐乐，今天小编就把这篇发表在Cell杂志（IF：41.582）上的题为“Proteogenomic characterization of pancreatic ductal adenocarcinoma”的文章分享给大家。万字长文，内容丰富，结构清晰，如果你时间紧张，可以跳过中间详解，只看“摘要”和“讨论”两部分。如果你和小编一样爱学习，爱思考，那就从头慢慢欣赏学习吧~

摘要

胰腺导管腺癌(PDAC)是一种高度侵袭性的癌症，患者生存率低。为了了解驱动PDAC肿瘤发生的潜在分子改变，作者对140例胰腺癌、67例正常癌旁组织和9例正常胰腺导管组织进行了全面的蛋白质基因组分析。采用蛋白质组学、磷蛋白质组学和糖蛋白组学分析来表征蛋白质及其修饰。此外，对同一组织进行全基因组测序、全外显子组测序、甲基化、RNA测序(RNA-seq)和microRNA测序(miRNA-seq)，以进行综合分析，确定基因组改变对蛋白质表达、信号通路、和转录后修饰。为了确保下游分析的可靠性，通过多种正交策略评估肿瘤细胞形态，并通过基于组织学审查的肿瘤细胞性的病理学估计进行验证。这种全面综合的PDAC蛋白基因组特征对鉴定新的潜在治疗靶点及早期诊断标志物具有重大意义。

数据来源

作者收集了140例未经治疗的胰腺癌（35例PDAC和5例胰腺腺鳞癌）、67例正常邻近组织和9例正常胰腺导管组织进行了全面的多组学研究。进行全基因组测序、全外显子组测序、甲基化、RNA测序（RNA-seq）和miRNA测序、蛋白质组学、磷蛋白质组学和糖蛋白质组学的测序和分析，共获得了8组组学数据（图1A）。

样本是从全球多个地方前瞻性收集的，控制了缺血时间，可以确保高质量的蛋白PTM分析（图1B）。因为这些是手术切除的癌症，绝大多数患者处于I-III期，只有9名IV期患者，截至到本研究数据分析时，因42%的患者还活着（图1B），导致很多样本的肿瘤细胞并不多，为了解决这种低肿瘤纯度问题，作者根据以下3个标准确定了105个具有足够肿瘤纯度的样本。

(1).KRAS变异等位基因分数（VAF）不小于 0.075；

(2).显著的突变负荷和拷贝数变异（CNVs）（图1C和1D）。

(3).基于反卷积方法，使用组织学以及基于DNA甲基化和RNA的不同的分子数据模式估计肿瘤细胞占比（图S1C)。

上述确定的105个“高肿瘤纯度”的样本纳入本分析，此外低纯度的样本也被保留下来，用于探测肿瘤微环境和肿瘤亚型。

结果展示

1. PDAC队列的蛋白质基因组景观

蛋白质组学、磷酸蛋白质组学和糖蛋白质组学分析共鉴定和定量了11,662 个蛋白、51,469 个磷酸位点和34,024个糖肽。作者发现整个 TMT plex 的质量控制样本的测量重现性很高，并且没有观察到 TMT plex 效应（图S1A）。在这项研究中，RNA 和蛋白之间的相关性中位数为 0.35（图S1B），表明RNA和蛋白丰度之间存在差异，这在其他癌症类型中也观察到。当分别对肿瘤和 NAT 进行相关性分析时图S1B），观察到 NAT组内的中值相关性相对于肿瘤组降低，这在其他肿瘤类型中也存在，这可能是由于细胞类型特异性的翻译调控。

使用不同的分子数据模式估计肿瘤细胞占比，发现这些肿瘤细胞的估值与KRAS VAF估值显著相关，特别是采用基于DNA甲基化反卷积获得的肿瘤细胞的估值与KRAS VAF估值高度相关（图S1C)。除了105个具有足够肿瘤纯度的样本，其余35例肿瘤纯度较低，但它们确实含有肿瘤细胞，其他显著突变基因(SMG)突变，低KRAS VAF，以及病理学检查（图1C）都证实了这一点。磷酸化和糖基化水平表明，高纯度肿瘤和NAT样本是分离的，但低纯度的样本在空间上位于高纯度肿瘤和NAT样本之间，支持本研究中的纯度分类（图S1D）。

2. 基因组改变对转录组、蛋白组和磷酸化的影响

在105个具有高纯度肿瘤细胞的组织样本中，在已知的胰腺癌驱动基因KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4中检测到体细胞基因组改变，其比率分别为97%、83%、48%和29%（图2A）。其中CDKN2A和SMAD4的变异百分比，由于包含了CNV和融合因此比较高。除了KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4这四个主要的突变基因，作者还在至少5%的肿瘤中检测到ARID1A、RNF43、GNAS、KMT2C、KMT2D、TGFBR2和RBM10的改变（图2A）。

作者全面描述了基因改变对相应基因产物（RNA、蛋白和磷酸化）的顺式（cis）和反式（trans）影响（图2B-C）。结果发现，TP53突变在蛋白和磷酸酶水平上具有最大的反式效应，在RNA/蛋白水平和磷酸酶水平上影响的基因具有很大差异，猜测这可能是由于广泛的翻译后调控。

TP53的突变与参与DNA损伤修复通路的蛋白（如MSH6、TP53和TP53BP1）的磷酸化增加有关，这表明这些改变在维持基因组完整性和防止细胞凋亡方面起作用（图2C）。在TP53突变异肿瘤中，作者还观察到MKI67的磷酸化程度更高，MKI67是细胞增殖的标志，这意味着这些突变可能导致细胞生长速度增加。作者进一步分析了TP53错义突变与截断突变的效应差异。发现TP53错义组与野生型组相比，TP53蛋白表达和TP53-S315磷酸位点表达的顺式效应明显更大，而截断组与野生型组之间的TP53蛋白顺式效应没有明显变化。有趣的是，作者发现错义组和截断组都有类似的反式效应，这与DNA损伤修复通路中蛋白的磷酸化水平较高有关（图S2A）。

SMAD4突变与SERPINE1在RNA和蛋白水平上的下调有关，SERPINE1是已知的转化生长因子β（TGFβ）通路的靶点，与MAPK3蛋白表达和下游的MAPK信号（E2F4磷酸化）的上调有关（图2B）。

拷贝数变异(CNVs)包括染色体9p、11q、18q和22q臂的扩增、GATA6病灶扩增、以及CDKN2A缺失（图2D-E）,导致基因、蛋白和磷蛋白显著表达变化（图S2B）。由于观察到大量扩增，所以作者接下来着重于在扩增的病灶内识别新CNV驱动因素（图2E-F）。在扩增峰内的543个基因中，有165个拷贝数与相应RNA显著相关，其中的23个也与相应蛋白显著相关（图2F）。通过这种方法找到的蛋白体现了 CNV 事件潜在的新型顺式效应，并与肌动蛋白丝和细胞骨架形成相关（图2F-G），肌动蛋白纤维的重组被报道与肿瘤发生和转移有关。

此外，大多数受CNVs反式调控的蛋白位于7、9、17和18号染色体内，而CNVs在磷酸化水平上的反式效应比较零散（图S2C），SMAD4和CDKN2A的CNV缺失与SMAD4和CDNK2A mRNA水平较低有关，HDAC1在S406、S410和S421以及SMARCA4在S613的较高磷酸化与SMAD4缺失有关，而CDKN2A缺失与NPM1在S70和S214的较高磷酸化有关（图2I）。

为了识别可能受肿瘤中DNA甲基化调节的蛋白质，作者将RNA、蛋白质和磷蛋白水平与启动子DNA甲基化（图S2D）相关联。结果显示，GSTM1甲基化导致相应的RNA和蛋白下调，这与GSTM1在多种癌症中的报道一致。启动子DNA甲基化的程度在NAT中比在肿瘤中低（图S2E-F）。作者确定了86个表观遗传学沉默的基因，其中22个是癌症基因组图谱（TCGA）以前报道的。有两个基因（ZNF544和THNSL2）在超过10%的肿瘤中存在表观遗传学沉默，与患者的生存有显著关联（图S2G-I）。通过基于甲基化的亚型确定了两个聚类（聚类M1和M2），其中聚类M2拥有更广泛的DNA高甲基化。作者还发现这些肿瘤的细胞性和甲基化状态之间的正相关，与TCGA报道一致。

3.鉴定早期PDAC特定分子特征，用于肿瘤诊断和预后

大约80%的PDAC肿瘤无法切除，因为患者是在晚期被诊断出来的。因此对于这些患者来说，如果找到早期检测稳定性的生物标志物可能会提高生存率。相对于NATs而言，肿瘤中失调的蛋白、磷酸化位点和糖基化位点代表了早期检测/预后的潜在标志物。

相对于NATs，2218个和2244个蛋白在PDACs中分别明显下调和上调（图3A）。在NATs中具有高丰度的蛋白与正常的胰腺功能有关，而在肿瘤中上调的许多蛋白则富含参与表皮和内胚层发育的蛋白。为了确定与PDACs相关的蛋白，作者重点关注222个相比于NATs，在肿瘤中丰度增加2倍的蛋白（图3A）。调整基质和免疫含量后，仍然有27个蛋白在PDAC中仍显著上调2倍。此外，我们还发现，PDACs和NATs之间的差异表达与PDACs和正常胰管之间的差异表达相似(图S3A)，而且在27个蛋白中，有21个蛋白与正常胰管相比上调2倍(图3B，S3B)。重要的是，这27个蛋白在早期肿瘤中同样受到调节（图3B）。其中12个是分泌蛋白，可作为血清或胰液的早期检测标志物。据报道，在胰腺癌数据库中有11个蛋白表达升高，其中6个蛋白（HK2、LOXL2、COL12A1、C19orf33、TSPAN1和MDK）以前只得到RNA或细胞系蛋白组证据的支持，LOXL2蛋白丰度与总生存期缩短有关（图3C）。在图3B中强调的21个肿瘤相关蛋白中，通过独立采集（DIA）质谱分析确定了14个作为早期检测或预后标记的潜在蛋白。

与NATs相比，4908个磷酸化位点和1727个N-链接糖基在PDACs中的丰度明显增加。一般来说，PTMs的丰度差异与蛋白水平的丰度差异相似，而45个N-链接糖位点和645个磷酸化位点的丰度上调>2倍，但蛋白丰度没有相应增加（图3D）。例如，虽然RALGAPA2的蛋白丰度在PDACs中下降（图S3C），但S486和S696的两个磷酸位点增加>2倍，而其他三个磷酸位点下降或与NAT相似（图S3D）。据报道，RALGAPA2与胰腺癌的KRAS信号传导有关，作者认为在将来的研究中可能需要探索这些特定位点的功能。

除了蛋白丰度外，这些PTMs中有许多与患者的预后有关。总体而言，PTMs的预后价值与蛋白的预后价值相似（图3E）。然而，APOD上的一个特定的N-链接糖基化与较好的总生存率有关，而总蛋白丰度则没有（图3F）。虽然APOD的表达减少与其他类型的癌症预后较好有关，但对这个糖基化位点的作用及其对APOD功能的影响知之甚少。此外，参与上皮-间质转化的PIGR上的两个磷酸化位点与预后较好有关，而ERBB信号调控因子ERRFI1上的一个位点则与生存率较差有关（图3E）。

4.靶向糖蛋白生物合成，用于早期发现和治疗干预

大多数糖蛋白是膜结合蛋白或分泌蛋白，可作为免疫治疗和疾病检测的潜在对象。PDACs和NATs的糖蛋白质组学分析确定了75种N-连接糖蛋白在肿瘤中蛋白水平上调>2倍（图4A，S4A-B）。其中，57个在胰腺癌数据库中被报道过，18个是在本研究中新发现的。在75个肿瘤相关糖蛋白中，有48个通过DIA分析得到进一步验证。此外，与NAT和正常胰管组织相比，CA19-9抗原有关的粘液型O-连结糖蛋白在肿瘤和早期肿瘤显著上调（图S4C）。

作者根据不同的KRAS热点突变（G12D、G12V、G12R和Q61H）进一步区分了肿瘤与正常胰管组织的N-链接糖蛋白表达（图4B）。有趣的是，CEACAM5和CEACAM6在携带KRAS G12D、G12V和Q61H突变的肿瘤样本中明显上调，而在G12R突变的肿瘤样本中没有发现这种现象（图4B-D）。据报道，CEACAM6是PDAC患者预后不良的标志物，CEACAM6 过度表达与PDAC 中的低细胞毒性T细胞有关。此外，从早期肿瘤中N-连接糖蛋白表达中，发现了包括半胱氨酸结合蛋白3（LGALS3BP）的几个早期检测或治疗的候选物（图4B、S4E）。

N-连结糖蛋白的生物合成主要受两个因素调控，即糖蛋白基质和糖化酶。虽然完整糖肽(IGPs)的变化模式主要与糖蛋白底物的蛋白质丰度呈正相关(图4C)，但IGP与蛋白质特征并不总是一致的，正如研究中描述的IGP丰度异质性一样，在病理组织类型中显示出不同的糖分支模式。总的来说，在肿瘤中上调的N-连接糖蛋白主要是由带有水杨酸和/或岩藻糖的复合糖修饰，而在肿瘤中下调的N-连接糖蛋白主要由高聚甘露糖修饰（图4C）。这些数据表明，关注PDAC中上调的N-链接糖蛋白的水杨酸化和/或岩藻糖化的糖类，可能会增加癌症的标记物的特异性。

接下来，作者根据糖基化生物合成酶的丰度水平，研究糖基化改变的内在机制（图4D）。结果发现，水杨酸化和/或岩藻糖化的IGPs与糖化酶的表达相关（图4D）。比较糖基化酶的表达，发现与NATs相比，肿瘤中的糖基化酶(ST6GAL1、ST3GAL1、FUT3、FUT11、B4GALT1、B4GALT4、B3GALT5和ST6GALNAC1)表达上调（图4E）。其中一些糖基化酶的变化，如肿瘤中ST6GAL1、ST3GAL1和B4GALT1的升高，在转录组水平未观察到（图S4F），突出了蛋白质组学和糖蛋白质组学在该研究中的附加价值。ST6GAL1和ST3GAL1调控水杨酸化，而FUT3和FUT11则负责岩藻糖基化，这与研究中观察到的PDAC上调蛋白主要由水杨酸化和/或岩藻糖基化糖修饰是一致的，抑制这些酶可能作为PDAC的潜在治疗策略。

5.激酶和底物的共同调控揭示了潜在的治疗靶标

由于具有KRAS驱动基因突变的肿瘤很难通过靶向治疗进行治疗，对于已知KRAS突变频率较高的PDAC，能否实现有效的治疗干预仍是未知的。在胰腺癌发生过程中，蛋白质磷酸化大量参与了各种信号通路。为了研究被激活的KRAS下游的信号转导通路，以寻找替代的治疗靶点，作者分析了激酶各自磷酸化底物上的蛋白磷酸化事件。

通过分析41个肿瘤/NAT配对组织之间磷酸化肽的差异丰度，作者对5种磷酸化底物（MCM2, FLNA, BAD, MAPK6和STAT3）进行了分层，这些底物对应于5种激酶（CDK7, AKT1, PAK1, PAK2和SRC），这些激酶的抑制剂要么已被美国食品和药物管理局（FDA）批准，要么正在研究中（图5A）。

有研究表明，磷酸化底物的升高与S期进入/进展（CDK7-MCM2）有关，抑制CDK7可导致细胞周期阻滞，抑制肿瘤进展。AKT1是KRAS的下游激酶（图5B），AKT1几乎在所有肿瘤中的表达上调都是KRAS突变的结果，而KRAS突变反过来刺激G1/S进程，进而刺激增殖活性。

一种Ⅰ类p21激活激酶，PAK1在超过70%的肿瘤中表达上调，PAK1对其底物磷酸化蛋白（BAD）S134位点的磷酸化可抑制BAD诱导的细胞凋亡，从而促进细胞增殖和存活。PAK1可以通过与RAC1直接相互作用而被激活，并且RAC1在大多数肿瘤中上调（图5B-C）。PAK1是多种受体酪氨酸激酶的重要效应物，如MET。作者发现MET和PAK1在肿瘤中同时上调，MET与KRAS、RAC1、PAK1和PAK2在肿瘤的转录和蛋白水平上也一致上调（图5C）。有研究报道，MET/PAK1信号轴通过调节细胞增殖、运动和细胞骨骼重塑来驱动胰腺致癌。

I类PAKs的另一个成员PAK2在近90%的肿瘤上调，并可能负责MAPK6-S189（图5A-5C）的磷酸升高。磷酸化过程对MAPK6信号通路中MAPK6-PRAK复合物的形成至关重要，表明PAK2活性在调节与细胞运动相关的非典型MAPK信号通路中发挥重要作用。

扩大磷蛋白组学分析范围，包括正常胰管组织，结果表明在PDAC肿瘤中，I类PAKs和其他激酶及其底物的表达谱与NATs和/或正常胰管组织有本质上的不同，表明这些蛋白是PDAC相关的激酶（图5D、S5A-B）。

此外，通过评估不同KRAS热点突变的肿瘤中相对于NATs的磷酸位点表达变化（图S5C），作者进一步分层了19个激酶（图5E），包括7个FDA批准的药物靶点。这些不同的激酶表达模式提示了与特定KRAS突变相关的替代治疗靶点。鉴于I类PAKs对PDAC的重要性，联合抑制PAK1/2和KRAS下游通路，如MAPK/ERK和PI3K/AKT/mTOR，可能会通过最大限度地抑制肿瘤细胞的增殖、运动和对细胞骨架的信号传导来增加治疗效果。

6. 与内皮细胞重塑、糖酵解和细胞连接失调有关的免疫冷PDACs

肿瘤和正常组织的分子分析的一个局限性是，它们不能完全剖析肿瘤内在生物学和微环境动力学之间的相互作用。这种认知差距对PDAC尤其重要，因为PDAC主要由肿瘤微环境特征驱动。本研究中，作者根据微环境细胞特征（主要是免疫浸润程度）来对肿瘤进行分类。使用基于转录组学的反卷积方法来划分本研究中所有140个肿瘤样本的细胞组成(包括低纯度肿瘤)。基于DNA甲基化的反卷积进一步证实了这一点（图6A、S6A-C）。根据肿瘤/基质/免疫细胞组成，样本被分为四个群组（图6A）。

作者认为，特别值得关注的是D群肿瘤，其CD8+T细胞浸润程度较高，并伴随着细胞毒酶和免疫检查点分子的表达增加。作者将这一集群的样本注释为"免疫热"肿瘤，这些病例的组织学检查证实了与肿瘤成分相关的显著炎症浸润(图S6D)。然而，在一个病例（C3N-00303）中，免疫标记很可能是收集的组织中包含了淋巴结的结果，突出了织学检查在任何癌症类型的研究中的重要性(图S6E)。而集群A、B和C中的样本几乎没有显示免疫浸润。由于集群A富含非肿瘤性的腺泡和胰岛细胞，作者认为只有集群B和C是真正的"免疫冷"肿瘤组（图S6F）。

值得注意的是，内皮细胞也富含免疫热肿瘤（图6B）。此外，细胞类型关联网络分析证实内皮细胞和细胞毒性免疫细胞之间存在很强的相关性（图S6G）。据报道，内皮细胞代表循环系统和肿瘤细胞之间的物理连接，内皮细胞粘附蛋白对免疫细胞募集至关重要，并且在肿瘤相关血管系统中经常下调，在此研究中免疫冷肿瘤内皮粘附蛋白表达降低（图6C）。同时，这些肿瘤也表现出VEGF和缺氧通路活性升高，这可以通过VEGF及其受体的表达以及推断的通路活性来说明（图6D）。VEGF和缺氧通路都是肿瘤发生过程中内皮细胞重塑的重要途径。综上所述，这些结果支持了免疫冷态PDACs中内皮细胞重塑和抑制免疫浸润的关联。

为了进一步分析免疫冷表型背后的机制，作者使用RNA、蛋白和磷酸化数据进行了通路分析。结果发现，免疫冷样本的糖酵解水平较高（图6E、S6H），包括负责生成和分泌乳酸的酶的富集，据报道乳酸是肿瘤微环境中已知的免疫抑制剂。此外，磷酸化特异性通路富集分析显示，免疫冷样本的细胞连接蛋白的磷酸化水平较高（图S6I）而在转录组或蛋白组水平上没有发现这种特征（图6F）。

细胞连接蛋白在调控内皮细胞对小分子的通透性和免疫细胞浸润方面发挥着重要作用。研究表明，细胞连接成分中的蛋白磷酸化失调可能代表了PDAC肿瘤中免疫排斥的一种机制。

这些数据共同表明，内皮细胞重塑，伴随着血管内皮生长因子和缺氧通路的升高，糖酵解增加，以及细胞连接失调，可能共同抑制了免疫细胞的浸润和功能（图6G）。抑制这些生物过程，尤其是糖酵解和内皮细胞重塑（这两者是多种癌症类型的积极靶点），可用于提高免疫冷型PDACs的抗肿瘤免疫功能。虽然CD8+T细胞浸润是一个有利的预后标志，但血管内皮生长因子和缺氧通路信号的升高都与生存率下降有关（图6H-I）。

7. 具有强烈预后功能的蛋白基因组亚型

作者将三种主要的基于转录组学的PDAC亚型策略应用于整个肿瘤组，以探索样本间异质性(图S7A)。与先前报道一致，一些分子分类明显重叠，如ADEX (Bailey)和外分泌样(Collisson)，经典(Collisson)和胰腺祖细胞(Bailey)，以及鳞状(Bailey)，准间质(Collisson)和基底样(Moffitt)。值得注意的是，本研究队列中的5个腺鳞癌样本被分为鳞状(Bailey)、准间质(Collisson)或基底样(Moffit)组，这与对组织学上胰腺癌亚型的理解一致。基于非负矩阵分解(NMF)的蛋白质基因组学分型，使用来自所有140个肿瘤的多组数据，发现4个与RNA亚型显著重叠的集群（图S7B-C）。整个队列的基于RNA和基于多组学的分型结果都严重受到肿瘤纯度和细胞类型组成的干扰(图S7B-G)。

为了减轻肿瘤纯度对亚型划分的影响，作者基于NMF的蛋白基因组学亚型限制在具有足够具有高肿瘤细胞占比的的105个PDAC肿瘤上。这一分析揭示了两个集群（C1和C2；图7A）分别与Moffitt经典亚型和Moffitt基底样RNA亚型有显著重叠。由于Moffitt亚型是通过使用肿瘤内在基因签名获得的，两种蛋白质基因组亚型之间的差异更有可能反映肿瘤内在生物信号，C2亚型与多种增殖信号通路活性升高和生存率降低相关(图7B-C)。

尽管来自多组学数据的蛋白质基因组亚型与仅来自RNA-seq数据的Moffitt亚型之间总体上一致，但22个肿瘤的分类是不一致的（图7A-C）。11例Moffitt基底样肿瘤被归类为蛋白质基因组经典型，11例Moffitt经典肿瘤被归类为蛋白质基因组基底样型。有趣的是，根据蛋白质基因组群分离Moffitt经典肿瘤或基底肿瘤显示了不同预后结果的趋势（图7D-E）。作者发现，在97个既有蛋白质基因组学又有Moffitt分型的PDAC样本中，蛋白质基因组学-二分类亚型比Moffitt-二分类亚型显示出更强的预后分离（图7F-G）。作者进一步分析了具有显著的预后价值的392个蛋白和258个磷酸化蛋白，发现蛋白质基因组学-二分类亚型（69%的蛋白质和78%的磷酸化蛋白）比Moffitt-二分类亚型（39%的蛋白质和38%的磷酸化蛋白）具有更显著的差异。

为了对这两个亚型进行深入分析，作者将分子特征、激酶的磷酸化模式、糖基化酶和综合蛋白基因组学提示的标志物，与C1和C2亚型相关联。C2亚型与图5强调的大多数激酶的高表达有关。基因组富集分析显示，化疗药物与C1（如多西他赛、乙烯利和卡巴他赛）和激酶抑制剂与C2（如PP-242、CP466722和舒尼替尼）有关联，C1或C2亚型中预测的相应药物靶点的表达升高进一步证实了这一点。例如，mTOR、AKT和ERK激酶表达的升高以及PP-242签名在C2中的富集表明，mTOR可能是这些患者的潜在治疗目标。

本研究的二分类蛋白质基因组学分型只集中在105个具有足够肿瘤纯度的样本，以便更好地理解肿瘤内在生物学。另一方面，免疫/微环境特征使用了所有140个样品，因为免疫热样品通常具有较低的肿瘤纯度（图S7I）。当140个样本进行蛋白质基因组分型时，观察到4个亚型（图S7B）。有趣的是，9个免疫热样本中的8个组成了C4亚型的子集（图S7I），这与Moffitt经典亚型显著重叠（图S7B-C）。通过进一步将微环境/免疫分析结果与胰腺癌相似方面的研究进行比较，作者发现免疫热样本的微环境特征更有利于免疫细胞浸润（图S6D）。

总之，这些结果支持整合蛋白基因组分型与患者预后的关联。在预后不良的蛋白质基因组基底样亚型中（图7B），对过度激活的增殖和信号通路进行进一步实验研究可能有助于开发亚型特异性治疗策略。

讨论

本文中，作者描述了PDAC的全面蛋白质基因组研究，整合了多基因组特征，从而有助于深入了解基因组和表观基因组扰动对基因和蛋白质表达以及PTMs的影响。

为了确保PDACs与成对匹配的NATs和正常的导管组织比较结果的可靠性，作者利用分子学、组织学和计算机算法，来注释队列中肿瘤的肿瘤细胞占比和正常组织的高细胞含量，其主要目的是使分析中只包括高质量的样本（图1和2），这种方法有力地识别了早期检测、诊断或治疗干预的潜在靶标（图3、4、5、6和7）。作者验证了KRAS是PDAC的主要驱动基因（图1和2），与先前报道一致。然而针对KRAS蛋白本身的治疗已经失败，因为它的表面拓扑结构光滑，缺乏安全药物结合的疏水口袋，导致除了化合物MRTX849之外，获批的KRAS特异性药物很少，而且只有不到1%的PDAC患者身上携带了KRAS G12C突变。

比较具有不同热点KRAS突变的肿瘤的糖蛋白表达，发现携带G12D、G12V和Q61H突变的PDAC样本中，CEACAM5和CEACAM6显著上调，但是携带G12R突变的样本无此变化（图4B）。CEACAM5和CEACAM6属于免疫球蛋白超家族；通过与其他同源或异源蛋白结合，介导细胞迁移、细胞侵袭和细胞粘附；并保护肿瘤细胞不发生失巢凋亡；虽然抗CEACAM5/6单克隆抗体（mAbs）对正常组织的影响仍有待确定，但mAbs MN-15和MN-3可以通过减少肿瘤细胞对内皮细胞和细胞外基质的粘附而阻碍转移。 因此，抗CEACAM5/6药物与一线化疗相结合，可能会使携带KRAS G12D、G12V和/或Q61H突变的PDACs患者受益；另外，抑制KRAS持续激活导致的关键下游目标和节点是 PDAC 治疗的一个有吸引力的策略。

MAPK/ERK和PI3K/AKT/mTOR通路是PDAC治疗干预的主要目标，每条通路的多种抑制剂都可以在临床上使用。作者对蛋白质组学和磷蛋白质组学检测发现，本研究大多数PDAC中，PAK1/PAK2激酶被上调（图5），这些激酶已被报道为介导细胞骨架运动、增殖和生存的重要信号通路的关键效应因子/调控因子。PAK1/PAK2位于肿瘤基因KRAS的下游，其抑制剂有可能成为靶向KRAS的新途径，并可能与靶向典型KRAS下游MAPK/ERK和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT/mTOR通路的抑制剂结合。

PDAC的特点是高度抑制性的肿瘤微环境，对于大多数患者来说，细胞毒性T细胞的肿瘤内浸润很低。尽管针对细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（CTLA-4）和程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）的免疫疗法使几种实体恶性肿瘤患者明显受益，但除了占PDACs<2%的微卫星稳定性高的肿瘤，它们对PDACs患者无效。人们对PDAC中免疫激活的决定因素知之甚少，几乎没有提供治疗指导。为了剖析肿瘤微环境，作者利用多组学数据，发现与VEGF和缺氧通路活动上调相关的内皮细胞的缺失，反过来又与免疫冷肿瘤中的免疫细胞排斥有关（图6）。通过血管生成疗法（如索拉非尼和NGR-TNF）将肿瘤内皮细胞重塑成正常的内皮细胞表型，可以实现白细胞内皮细胞粘附分子上调，并可能促进肿瘤内免疫细胞渗透。低氧诱导因子-1（HIF-1）是胰腺肿瘤中低氧微环境的主要效应器，并诱导细胞代谢进入糖酵解模式。因此，针对HIF-1活性靶向的方法，如防止HIF1-α和HIF1-β亚基相互作用的小分子，也可能对胰腺免疫冷肿瘤有益。

N-连接糖基化发生在内质网和高尔基体，由一系列糖苷酶和糖基转移酶的活性介导。在各种实体恶性肿瘤(包括PDAC)中，已经发现了水杨酸糖蛋白的异常表达，并与侵袭性和转移潜力有关。本研究发现，PDAC中大多数上调的N-链接糖蛋白是由水杨酸糖修饰的，与PDAC中ST6GAL1和ST3GAL1相对于NAT的上调一致（图4）。这些肿瘤上调的N-链接糖蛋白与参与PDAC进展和转移的重要信号通路有关（图S4B）。因此，用更具选择性的抑制剂来抑制这些水杨酸转移酶，可能会通过废除这些N-链接糖蛋白的功能来减弱PDAC细胞的生长、存活和转移。

该研究表明，通过在多个组学水平上描述疾病状态，可获得独特和有用的见解，从而使人们能够更深入地理解与PDAC相关的基因组畸变的功能后果。整合转录组、蛋白组、磷蛋白组和糖蛋白组的检测，以及PDACs、NATs和正常导管的比较分析，能够检测出与早期PDAC相关的蛋白形态，并确定可能在临床上找到的潜在治疗靶点。总之，本研究描绘了驱动PDAC表型的分子特征，并为未来的研究提供了丰富的生物信息源。

亮点

-蛋白基因组学特征揭示了基因组改变的功能影响

-磷蛋白质组学揭示了KRAS下游的潜在的治疗靶标

-多组学将内皮细胞重塑和糖酵解与免疫排斥联系起来

-蛋白质组学和糖蛋白质组学找到用于早期检测或干预的候选标志物

局限性

本研究的目的是利用多组学技术全面描述PDAC肿瘤和NATs，并提供蛋白质基因组特征，解读基因组改变对基因表达、蛋白质丰度和PTMs的影响。因为临床蛋白质组学肿瘤分析联盟(CPTAC)项目收集的组织是未经治疗和手术切除的。所以，本研究在数据选择上存在固有的局限性。

第一，虽然作者寻找了患者辅助治疗的数据，但目前的队列是未接受治疗的样本，这限制了对采用全身治疗的转移性疾病的外推，并且目前临床试验产生的转录组数据是有限的。

第二，蛋白质基因组数据为关联不同的分子改变提供了丰富的资源，这对于生成假说、破译分子功能或预测治疗方案至关重要。然而，该相关性的因果效应无法从本研究中确定。生物学假设或治疗预测需要使用细胞系，患者来源的异种移植(PDX)模型，或临床试验进行进一步的验证。

第三，本研究的蛋白质基因组测量使用了大块肿瘤和NAT组织，在这些组织中，无法充分考虑异质性对细胞和肿瘤微环境的影响。本研究中，作者选择那些具有足够肿瘤细胞的组织样本进行分析来解决这一限制。然而，如果能够采用激光捕获显微解剖测序(LCM-seq)或单细胞测序对组织进行表征，结果将更加精确。