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癌症相关成纤维细胞(CAF)一直以来都备受关注，今天小编要给大家分享的是一篇发表在Oncoimmunology（IF:8.11）上题为Landscape of cancer-associated fibroblasts identifies the secreted biglycan as a protumor and immunosuppressive factor in triple-negative breast cancer[1]的文章。就让我们一起来学习这篇文章的研究思路吧~
背景介绍
1.三阴性乳腺癌 (TNBC)
三阴性乳腺癌 (TNBC) 是指雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体 2 (HER2)均为阴性的一种特殊分子亚型的乳腺癌，约占全部乳腺癌的五分之一，是乳腺癌中预后相对较差的一类。
2.肿瘤微环境 (TME)[2]
肿瘤微环境 (TME) 是指肿瘤周围的直接生态位，由代谢环境中的各种类型的细胞组成。血管提供氧气和营养，并负责清除废物；其中的细胞主要包括基质细胞和免疫细胞，基质细胞和免疫细胞通过分泌信号分子和细胞外基质(ECM)成分来调节肿瘤生长。癌细胞的高代谢活性、血流功能失调和炎症增加，导致TME具有生理特性失调的特点。更详细的TME介绍请看Nature metabolism: 肿瘤微环境中的代谢和免疫。
3.癌症相关成纤维细胞 (CAF)[3]
癌症相关成纤维细胞 (CAF)主要是由组织中固有成纤维细胞或星状细胞在生长因子的刺激下转变而来，此外，肿瘤组织中的上皮细胞、内皮细胞、骨髓间充质干细胞（MSC）等细胞也可分化为CAFs。肿瘤组织中的CAFs具有异质性，不同亚型CAFs表面标志物表达情况不同。
CAFs 通过分泌各种细胞因子与其他基质细胞、肿瘤细胞进行信息交流，抑制免疫细胞功能，促进肿瘤发展；也可调控胞外基质，对药物与免疫细胞的浸润产生屏障作用。关注CAFs在肿瘤微环境中的功能和机制可能为乳腺癌治疗，特别是免疫治疗提供一种策略。想要了解更多的CAF研究思路，请移步火爆全网的癌症相关成纤维细胞(CAF)最全面总结。
4.METABRIC数据库[4]
METABRIC（乳腺癌国际联盟的分子分类学）是一项加拿大与英国合作项目，旨在根据有助于确定最佳治疗过程的分子特征将乳腺肿瘤分类为更多的亚类。这项研究涉及2000名乳腺癌患者的大型研究，揭示出乳腺癌能够被划分为10种亚型。可通过cBioportal（http://www.cbioportal.org/index.do）下载其中的数据。
数据来源
TCGA数据库中的的TNBC队列（含116名患者）、METABRIC-TNBC队列、GEO数据库中的GSE25066、GSE103091、GSE21653和GSE88715数据集以及scRNA-seq数据集（GSE114727、GSE136206、GSE138536等）。
分析思路
（上述流程图主要列举了文中用到的生信分析方法，除此之外本文还有相关实验验证）
结果
1. 基于CAF标记对TNBC队列分型
本文作者首先通过查阅文献收集了研究中报道的典型的CAF markers（包括ACTA2、FAP、PDGFRA、PDGFRB、PDPN、THY1 和 COL1A1的等），利用这些markers的表达情况对样本进行聚类，将样本分为markers高表达、中表达及低表达的三个亚型，并通过PCA来验证聚类分群的效果。见图1。
为了进一步分析上述不同亚型样本的成纤维细胞和免疫特征，作者分别在METABRIC-TNBC、TCGA-TNBC和GSE25066-TNBC队列中比较了不同浸润组中MCP-counter 和 xCell 的成纤维细胞评分，发现从低浸润组到高浸润组有明显的上升趋势。此外，作者还比较了iCAF 和 myCAF 标志物的表达，结果表明高、中浸润组样本中有大量CAF标志物明显上调，这说明这些组中的样本有大量浸润的CAF。见图2。
2. CAFs浸润与免疫特征的相关性
我们已知CAF在肿瘤微环境的免疫调节中具有关键作用，于是作者进一步研究了CAF与免疫之间的相关性。他们首先计算了METABRIC-TNBC、TCGA-TNBC 和 GSE25066-TNBC 队列中不同浸润组（高与低、中与低）之间基因的表达变化，筛选出免疫相关基因（图2c、f和i）。其次，作者在高浸润组和低浸润组中进行了GSVA分析，比较了两组样本之间的癌症标志性信号通路，发现部分免疫相关信号通路在高浸润组中显著富集（图3a-c）。接下来，作者还评估了CAF与免疫细胞之间的相关性，发现CAF与CD8+T细胞和活化的NK细胞呈负相关，同时可能与M2巨噬细胞有正相关性（图3d-f）。
3. BGN上调并主要在CAF基质中表达
为进一步研究与CAF相关的标志物及其相应的预后价值，作者利用RNA测序和质谱进一步研究分析NAF(正常癌症相邻成纤维细胞)和CAF组之间的差异表达基因。与NAF相比，BGN(Biglycan)在CAF中显著上调，且已有研究表明BGN在治疗的抵抗性和免疫活性中发挥作用。在这里，作者不但在TCGA-TNBC队列中也观察到了肿瘤组织中BGN显著上调，还利用Western实验进行了验证。见图4。
接下来，作者利用TNBC scRNA-seq数据在单细胞层面分析了BGN的表达情况（图5），发现BGN主要在TNBC中的成纤维细胞群中表达。同时又在另一个单细胞数据集中发现BGN主要在CAF和血管周围样（PVL）细胞群中表达。而且BGN的表达水平与成纤维细胞和内皮细胞有显著的相关性（图6）。这些结果进一步表明，BGN可能是TNBC中CAF特异性的生物标志物，并在细胞外基质中发挥其功能。
4. biglycan相关生物学和临床特征
BGN 基因编码的双糖链蛋白聚糖（biglycan），是一种细胞外可溶性蛋白质，可能通过细胞间接触发挥其功能。作者先是用BGN相关基因进行GO富集分析，结果发现参与癌症进展和TME调节的代表性信号通路在METABRIC-TNBC、TCGA-TNBC、GSE25066-TNBC队列中显着富集。于是作者进一步分析了BGN与免疫特征之间的相关性。首先是分析BGN与免疫相关基因之间的相关性，发现BGN可能影响免疫细胞浸润或调节免疫活性。于是作者又计算了BGN表达水平与STIMATE 分数之间的相关性，以及BGN与免疫成分之间的相关性。见图7。
在文章最后，作者将BGN与临床进行了关联分析。首先在表达水平上，TNBC样本中的BGN表达水平明显低于非TNBC样本。其次，通过Kaplan-Meier 分析发现， BGN表达水平较高的患者的生存情况更差。免疫组化分析也发现高biglycan表达的患者样本总体CD8+T细胞的浸润水平更低。生存分析表明，biglycan可能作为 TNBC 的不良预后标志物。见图8。
小结
目前而言，在三阴性乳腺癌中CAF与肿瘤细胞和免疫细胞之间的相互作用的研究还很少。本文作者通过结合普通转录组和单细胞转录组的数据研究了CAF 在TNBC中的作用及其功能的潜在新介质，最后确定了一种细胞外蛋白biglycan，作为TNBC的预后标志物和潜在治疗靶点。这篇文章可以说是公共数据挖掘加实验验证的一个典型套路了。
思路拓展
TME作为肿瘤赖以生存的基础，为肿瘤的增殖、转移、侵袭提供物质基础。TME非常复杂，其与肿瘤代谢和肿瘤免疫系统的相互作用十分密切。CAFs 对肿瘤发展有着重要的促进作用，因此，靶向调控 CAFs的肿瘤治疗策略有望抑制肿瘤进展。将这两者相结合用以对肿瘤靶向药的研究分析或将取得重大突破。
在数据分析方面，本文所用的数据主要是来自于公共数据，可见数据挖掘还是很重要的。但仅仅只有数据挖掘的能力还是不够的，得学会最大化利用公共数据，将不同类型的数据巧妙的结合起来。就像这项研究中，作者通过结合常规转录组和单细胞转录的数据来分析CAFs，既描述了基于CAF的不同样本分析，还描述了TNBC中CAF相关的marker基因在不同细胞的表达情况。不难发现，目前常规转录组和单细胞的结合是一个非常火的分析手段。
参考文献
