“简单的”circRNA分析竟发到27+！！！

circRNA的常规分析思路也可以乘风破浪，斩获高分。近年来，circRNA像一颗冉冉升起的星星，受到广大科研工作者的青睐，现在已经到了炙手可热的地步，细数近年来circRNA在国家自然科学基金获批项目的情况，早就已经成为非编码RNA界的研究热点。

文章简介：

本篇文章¹发表在Molecular Cancer上，在最近一年的影响因子为27.401比上一年增加了12.099。这篇文章发现并证明circRNF220对儿童AML的准确诊断可能是高效和特异的，并对复发预测有一定的意义。

背景知识：

环状RNA(circRNAs)是一个具有独特结构的转录本家族，已被证实在肿瘤发生中起关键作用，是潜在的生物标志物或治疗靶点。然而，在儿童急性髓系白血病(AML)中，只有少数circRNA具有功能特征。

思路总结：

结果解读：

• 儿童原发性急性髓系白血病circRNAs谱分析

散点图可视化显示，circRNA的表达水平是可变的，并且在不同的组之间是可以区分的(Fig.1A)。共有1,960个circRNA在急性髓系白血病和对照样本之间差异表达，其中1001个circRNA表达上调，959个circRNA表达下调。染色体1和2含有大量差异表达的circRNA(Fig. 1B-C)。在急性髓系白血病中，大多数差异表达的circRNA是从外显子转录而来的(Fig.1D)。大多数异常circRNA的长度小于1500个核苷酸，中位数长度为372个核苷酸(Fig.1E)。然后，通过系统聚类法确定了前10个上调和下调的circRNA (Fig. 1F)。综上所述，作者观察到在儿童原发性AML中circRNA表达的显著差异，支持了研究circRNA在髓系白血病发生中作用的重要性。circRNF220是在广泛的样本验证过程中确定的最佳候选(Fig.1G)。作者发现，与健康对照组相比，原发性AML患者的circRNF220表达持续且显著增加。值得注意的是，circRNF220在小鼠的各种组织中普遍表达，在骨髓、脾和肺等造血组织中高度富集(Fig. 1H)。此外，在作者调查的儿童白血病和其他血液系统疾病(包括ALL、MDS、JMML、CML、ITP、贫血、淋巴瘤和血小板减少症)中，circRNF220在儿童AML中高表达(Fig. 1I)。

• 急性髓系白血病circRNF220基因的鉴定与验证

接下来，作者验证了circBase数据库和circBank数据库中是否存在circRNF220。基因组结构显示，circRNF220位于1p34.1，含有一个较大的第二外显子(742bp)，该外显子来源于RNF220基因，右侧有较长的内含子(Fig.2A)。为进一步鉴定circRNF220，检测cDNA和gDNA中的线性转录本。PCR结果表明，用不同的引物从cDNA中扩增出环状条带，但不能从gDNA中扩增出环状条带，而从cDNA和gDNA中扩增出环状条带(Fig. 2B)。然后作者研究了circRNF220在原代AML细胞中的稳定性和定位。用转录抑制剂放线菌素D处理后，在指定的时间点收集总RNA。对circRNF220和RNF220 mRNA的分析表明，circRNA亚型非常稳定，转录本的半衰期超过48h，而线性转录本的半衰期为4h (Fig.2C)。QRT-PCR分析RNase R处理的AML细胞中circRNF220和RNF220 mRNA的丰度，证明circRNF220在形式上是圆形的(Fig. 2D)。此外，qRT–PCR分析细胞核和细胞质circRNF220的表达，以及circRNF220的FISH结果表明，circRNF220优先定位于细胞质，当然也有适度的比例定位于细胞核(Fig. 2 E–F)。综上所述，作者的结果表明，circRNF220是一种在儿童AML细胞中表达丰富且稳定的circRNA。

• circRNF220在小儿AML中的潜在诊断和预后预测价值

鉴于circRNAs在白血病诊断和治疗中的巨大作用，作者探讨了circRNF220的临床价值。作者首次发现，与健康对照组相比，几乎所有AML亚型(除M6/M7外)患者的circRNF220表达持续且显著增加(Fig. 3A)。根据队列中circRNF220表达的中位数水平，作者将儿童AML患者分为高表达组和低表达组，以确定circRNF220表达是否与临床病理特征相关。然而，现有的病理数据并无显著差异(Table 1)。接下来，作者进行ROC曲线分析，以检验circRNF220表达在AML患者与健康对照和其他血液病患者之间的潜在诊断价值(Fig.3B)。有趣的是，研究结果表明，circRNF220在急性髓系白血病患者的外周血样本中也有明显较高的表达(Fig.3C)。此外，应用ROC曲线分析检测外周血中circRNF220表达的潜在诊断价值(Fig. 3D)。提示无论是骨髓还是外周血中的circRNF220都有相当大的潜力作为诊断生物标志物。为了确定影响AML预后的生物学机制，作者验证了RNF220在不同治疗阶段AML患者中的表达。在新诊断的AML患者中，circRNF220的表达水平明显高于健康对照组(Fig. 3E)。Wilcoxon符号秩检验结果显示，几乎所有配对的CR样本中，circRNF220的表达都显著降低(Fig. 3F)。这些结果证实了circRNF220在AML进展阶段的动态表达，提示其在白血病的发生和复发中可能起着复杂的作用。在对这些患者进行随访后，作者发现在确诊时复发患者的circRNF220表达几乎是其余持续CR患者的2.5倍(Fig. 3G)。作者观察到在诊断时高表达的RNF220患者的RFS率(79.07%)低于低RNF220表达的患者(Fig.3H)。作者得出的结论是，初诊时的circRNF220表达水平是儿童AML患者复发的独立和可靠的预测因子。

• circRNF220对人急性髓系白血病细胞增殖的促进作用及对凋亡的影响

接下来，作者试图研究circRNF220对白血病细胞增殖和凋亡的影响。如图所示(Fig.4A), circRNF220过表达显著加速AML细胞增殖。此外，circRNF220的上调显著降低了G0/G1期细胞的百分率，增加了S期和G2/M期细胞的百分率(Fig.4B-C)。值得注意的是，circRNF220的过表达导致更大的核质比和更少的分叶状核，表现出未成熟的外观(Fig.4D)和下调THP-1细胞CD11b和CD14的表达(Fig.4E-F)。通过不同的检测方法观察到急性髓系白血病细胞系的凋亡显著减少(Fig. 4G-I)。有趣的是，原代AML细胞在circRNF220 kD后，Annexin V染色显示细胞总数减少，凋亡迅速(Fig. 4J-K)。这些数据共同表明了circRNF220在急性髓系白血病中的功能相关性。

• AML细胞中circRNF220调控的异常转录网络

为了明确circRNF220在AML细胞中的转录功能，作者利用RNA-seq技术分析了3例儿童AML患者在LV-sh-circRNF220感染后原代细胞中的基因表达。共有107个mRNA(62个下调，45个上调)在所有三个样本(Fig. 5A-B)。为了确定circRNF220调控的分子途径，作者对常见的异常转录本进行了KEGG分析。作者观察到与细胞凋亡、溶酶体和急性髓系白血病相关的基因正向富集(Fig. 5C)。作者还应用GSEA来识别由circRNF220缺失而产生的不同调节通路，并发现所有三名AML患者共有的几条GSEA通路在统计学上显著失调。参与发育的凋亡过程也有显著的P值和归一化富集分数1.34(Fig. 5D)。作者在AML-E697细胞中独立评估了几个凋亡相关基因(Fig. 5E)。发现AKT、XIAP、ARF1、BAG5等抑制凋亡基因的表达明显下调，促凋亡基因BIM表达上调(Fig.5F)。值得注意的是，作者还显示，造血功能的标准富集分数为-1.26 (Fig.5G)。然后作者想知道在AML复发过程中，circRNF220是否与克隆群体的丰富或维持有关，通过对文献的系统回顾，作者调查了与AML复发相关的一个潜在的基因图谱。作者从作者的转录组数据中验证了HL-60过表达系统中与复发有关的差异表达基因 (Fig. 5H-I)。综上所述，这些数据表明，circRNF220在细胞凋亡和AML复发中起着重要作用。

• circRNF220可以吸附miR-30a

由于circRNAs通常通过与miRNAs相互作用发挥作用，因此作者寻找与circRNF220相互作用的候选miRNAs。通过计算预测，作者确定了5个候选者(miR-30a/b/c/d/e)。它们的预测结合位点位于circRNF220中高度保守的AGO-binding位点内(Fig. 6A)。利用作者队列中的一个子集(n=36)的miRNA表达数据，作者分析了这些miRNA和circRNF220表达之间的相关性。只有一种miRNA miR-30a的表达与circRNF220的表达显著相关.(Fig. 6B) 正如预期的那样，circRNF220kD增加了AML细胞中miR30a的丰度(Fig. 6C) 随后，作者进行了RNA下拉实验，观察到miR-30a在原代AML细胞和AML细胞系中显著富集 (Fig.6D)。然后作者增强miR-30a的表达，发现miR-30a 的过表达在AML细胞中与阴性对照细胞相比显著降低了癌基因EKL3和IER2的丰度(Fig. 6E)。与miR-30a在RNF220kD附近上调一致，ELK3和IER2的丰度显著降低 (Fig. 6F)。同样，除BIM外，其他靶基因，如GLUD2和MYSM1，在miR-30a OE细胞和circRNF220 kD细胞中均下调。(Fig. 6E-F) 接下来，作者应用GSEA找出了受circRNF220抑制的不同调控通路，发现miR-30靶分子显著下调，这与上面的发现是一致的(Fig. 6G)。为了解AML患者中circRNF220和miR-30a靶基因之间的关系，作者发现ELK3、IER2、GLUD2和MYSM1在初发AML患者和复发患者的评估样本中的相对丰度始终高于CR患者和健康对照组的样本(Fig. 6H)。此外，miR-30a的OE可显著抑制由增强circRNF220表达所诱导的HL-60和K562细胞的增殖(Fig. 6I-J)。重要的是，经miR-30a处理的HL-60细胞有明显的凋亡迹象，并且通过转染miR-30a可以恢复由circRNF220的OE诱导的HL-60细胞凋亡的显著增加(Fig. 6K)。综上所述，这些数据表明，circRNF220可能作为内源性miR-30a海绵隔离miR-30a并抑制其活性，从而导致其下游靶标水平的增加，包括MYSM1和IER2。

全文小结：

作者发现了一种circRNA，circRNF220，它在AML患儿的外周血和骨髓中特异性地丰富和积累，具有较高的敏感性和特异性。值得注意的是，circRNF220的表达独立预测预后，而circRNF220的高表达是复发的不良预后标志。从机制上讲，circRNF220可能作为miR-30a的内源性吸附海绵，隔离miR-30a并抑制其活性，从而增加其靶基因MYSM1和IER2的表达，参与AML的复发。

参考文献

1. Liu X, Liu X, Cai M, et al. CircRNF220, not its linear cognate gene RNF220, regulates cell growth and is associated with relapse in pediatric acute myeloid leukemia. Mol Cancer 2021; 20(1): 139.