知识中心 - 北京概普生物科技有限公司(GapTech)

最新：人类Treg未被识别的效应器亚群和双路径分化结构

文献解读 SCI ·2021年11月5日 19:00

最新：人类T_reg未被识别的效应器亚群和双路径分化结构

今天给大家介绍一篇单细胞测序的文章，人FOXP3⁺调节性T(Treg)细胞是免疫耐受的核心细胞。然而，它们的异质性和差异性仍不完全清楚。在这里，作者使用单细胞RNA和T细胞受体测序来解析接受干细胞移植的健康人和患有或不患有急性移植物抗宿主病(AGVHD)的患者的Treg细胞。轨迹分析将Treg亚群组装成两条分化路径(I/II)，分别以FOXP3^hi和MKI67 ^hi亚群结束，具有不同的表型和功能程序。这些发现扩大了对树突状细胞异质性和分化的理解，并为剖析健康和疾病中树突状细胞的复杂性提供了单细胞图谱。文章发表在期刊: Nature Communications在最近一年的影响因子: 14.919比去年增加了 2.798。中科院大类: 综合性期刊 1区。中科院小类: 1区综合性期刊。

背景知识：

GVHD：急性移植物抗宿主病

PB：外周血

BM：骨髓血

结果解读：

ScRNA-seq可在人FOXP3⁺T_reg细胞中分辨出不同的亚群

作者首先对健康供者和伴有或不伴有aGVHD的allo-HSCT患者的T_reg细胞进行了scRNA-seq检测。用10倍基因组学平台对健康供者和伴有或不伴有aGVHD的异基因造血干细胞移植患者外周血和骨髓中分离出的CD4⁺CD25⁺CD127⁻T_reg和CD4⁺CD25⁻常规T (T_con)细胞进行单细胞RNA-序列分析（Fig.1a）。最后，定义了健康供者外周血和骨髓Tregcell中的9个簇(Fig.1b)。根据幼稚和效应性Treg细胞的标记物，包括CCR7、HLA-DR和FOXP3，以及PB(P0，P3，P5)和BM(B0，B1，B4)中每个簇0，3，5和0，1，4的前10个签名基因和签名转录因子，与CCR7^hiTCF7^hiHLA-DR^lowFOXP3^lowprofile完美匹配原始状态（Fig.1c, d）。此外，基于PAGA（the partition-based graph abstraction）映射显示了幼稚（原始）群集之间以及激活/效应器群集之间的高度连通性(Fig.1e)。P8和B8被命名为MKI67^hi效应器亚群。尽管FOXP3^hi和MKI67^hiT_reg细胞亚群在PB和BM之间高度保守，但它们也显示出组织特异性的基因表达差异(Fig.1f)。为了比较不同簇之间的功能/稳态特征，进行了基因集变异分析(GSVA) (Fig.1g)。

Fig. 1 ScRNA-seq and TCR-seq reveals distinctive subsets among human FOXP3⁺T_regcells.

ScTCR-seq揭示了Tregcell亚群之间的扩增和转变

TCR由单个T_reg细胞克隆唯一表达。为了追踪单个Treg细胞的扩增历史，在11,830个分选的FOXP3+Tregcell和1,519个分选的T细胞中同时进行了scRNA-seq和配对scTCR-seq。原始、FOXP3^hi或MKI67^hi亚群中没有或极少数细胞含有克隆扩增的TCR (Fig.1h)。

T_reg细胞亚群的体外测定

为了在体外评价Treg亚群的功能和动态平衡特性，作者确定了不同簇的细胞表面标记候选(Fig.2a)。并且通过流式细胞仪分选，从外周血中分离出簇群(Fig.2b)。FOXP3^hi和MKI67^hi亚群中的细胞最大，分别显示FOXP3和Ki67蛋白的最高表达(Fig.2c, d)FOXP3^hi和MKI67^hi亚群对应答T(Tresp)细胞增殖的抑制作用最强，其次是LIMS1^hi和HLA-DR^hi亚群，然后是其他激活/效应亚群(Fig.2e)。在培养过程中，激活/效应亚群的凋亡率比大多数幼稚亚群略高。另外，培养的LIMS1^hi亚群细胞中有很大一部分丢失了FOXP3蛋白。LIMS1^hi亚群很少表达Helios(由IKZF2编码)，Helios被认为是胸腺来源的Treg细胞的潜在标志。

Fig. 2 In vitro assay of T_regcell subsets.

伪时分析揭示的两条效应器分化途径

为了描绘子集之间的层次和发展关系，作者使用伪时间分析。这一发现意外地揭示了PB和BM的两条效应器分化途径(称为PAYH I和PAYH II) (Fig.3a)。确定了PAYH I(如PTPRC、DDX17、MALAT1和PDE3B)和PAYH II(如HLA-DR、LGALS1/3和CD74 (Fig.3b)。GO分析表明，在PB和BM中，分支前富集基因与内质网(ER)的翻译和蛋白质靶向有关，PAYH I富集基因与细胞间粘附和细胞聚集有关，PAYH II富集基因在免疫系统过程中起作用(Fig.3c)。GSVA结果显示，与PAYH I细胞相比，PAYH II细胞表达更高的TCR、激活、抑制、迁移、凋亡、S和G2/M基因集(Fig.3d)。 PATH I细胞优先表达FAO基因组，PATH II细胞主要表达糖酵解和TCA基因组(Fig.3d)。PAYH II末端高表达可溶性抑制基因LGALS1、TGFB1、GZMA、IL10、IL12A和增殖基因TOP2A、PCNA、HMGB2，S+G2/M细胞比例稍高(Fig.3e)。TCR分析表明，大多数扩增的TCR克隆型都在Path II细胞中(Fig.3f)。共享的TCR主要在Pre-branch和Path II之间以及Path径II和Path I之间观察到，这表明从Pre-branc到Path II的显性分化以及Path II和Path I细胞之间的过渡(Fig.3g) 而Path II MKI67^hi组子集没有过渡到Path I单元(Fig.3h)这提示MKI67^hi亚群可能是一个特殊发育的亚群。

**Fig. 3 Pseudotime analysis and scTCR analysis defines two differentiation paths.**

两种分化途径的体外测定

识别不同PAYH的表面标记以验证两条PAYH的属性。途径I细胞表达较多的CD25和CTLA4蛋白，而途径II细胞表达更多的IL 10和转化生长因子β1蛋白(Fig.4a, b)。然而，GZMA、GZMB和LAP蛋白的表达总体上是非常低的，并且在PAYH II和PAYH I细胞中仅略有不同(Fig.4b, c)。在体外，PATH I细胞比PATH II细胞和分支前细胞具有更强的抑制能力但更弱的增殖能力(Fig.4d, e)。因此，单细胞转录与功能分析相结合，在T_reg细胞中定义了两条效应器分化途径。

Fig. 4 In vitro assay of T_regcell paths.

富集于两条分化途径的转录因子

为了了解分叉分化的转录因子基础，作者鉴定了PB T_regcell中每条途径的标志性转录因子。TCF7、FOXP3和SUB1分别是来自PB的分支前细胞、PAYH I细胞和PAYH II细胞中最重要的标志性转录因子（Fig.5a）。单细胞相关分析表明，FOXP3在单个细胞中优先与途径I相关的抑制基因IL2RA、CTLA4和FGL2共表达，而SUB1经常与途径II相关的抑制基因EBI3、IL12A、IL10、TGFB1、GZMA、GZMB和LGALS1共表达，与增殖基因MKI67、MCM6、TOP2A、PCNA和CYCLINs共表达(Fig.5b)。重组慢病毒感染T_con和 T_reg细胞后Foxp3和SUB1成功过表达(Fig.5c, d)。Foxp3过表达使IL2RA、CTLA4、FGL2、PRF1和IL12AmRNA水平升高。SUB1过表达增加Tregcell中IL10、HMGB2和MKI67mRNA水平(Fig.5e) SUB1过表达增加IL10蛋白水平，轻度增加Ki67蛋白Tregcell (Fig.5f–j)。

**Fig. 5 Transcription factors enriched in Tregcell differentiation paths.**

伴或不伴aGVHD的allo-HSCT患者的T细胞亚群

异基因造血干细胞移植后T_regcell大量再生，但如果并发aGVHD，其功能和数量会受到损害。结果表明，FoxP3亚群(非aGVHD P4、aGVHD P6、非aGVHD B6、aGVHD B4)和MKI67亚群(非aGVHD P5、aGVHD P7、非aGVHD) (Fig.6a–c)。这些结果表明FOXP3^hi和MKI67^hi组亚群在异基因造血干细胞移植后仍保持其特性，但其他效应树突状细胞发生了显著的变化。T_reg亚群的GSVA分析表明，非aGVHD患者的效应T_reg亚群比健康献血者的抑制相关基因表达略高(Fig.6d)。FOXP3^hi或MKI67^hi亚群在非aGVHD和aGVHD条件下几乎没有差异表达的基因(Fig.6e)。

Fig. 6 T_regsubsets in allo-HSCT patients with or without aGVHD.

伴或不伴aGVHD的allo-HSCT患者的T_regpath

来自allo-HSCT患者的Tregcell保留了两条分化途径，大部分在PATH I末端有FOXP3^hi亚群(非aGVHD BM除外)，在PATH II末端有MKI67^hi亚群(Fig.7a)。GSVA显示，在异基因造血干细胞移植患者中，PAYH II仍然比PAYH I具有更高的TCR信号、抑制、迁移、细胞周期、凋亡、糖酵解和TCA，这与在健康供者中的观察结果相似(Fig.7b)。对单个基因的检测显示，与非aGVHD患者相比，aGVHD患者在分支前表达较低水平的CCR7和CXCR6，在PATH I中表达较低水平的CTLA4、PRF1、GZMA、TGFB1、CCR3、CCR5、CCR9、CCR10、CXCR3和CXCR6，较低水平的CTLA4、ENTPD1、GZMA、CCR1/2/3/5/7/9、CZMA和CCR1/2/3/5/7/9、CZMA(Fig.7c)。这些结果提示，aGVHD树突状细胞在抑制和迁移过程中存在PAYH特异性缺陷。

Fig. 7 T_regPaths in allo-HSCT patients with or without aGVHD.

全文小结：

综合的研究揭示了人类T_reg以前未被识别的效应器亚群和双路径分化结构。这些方面在PB和BM之间以及稳态条件和免疫紊乱之间是保守的。阐明了不同亚群和途径中与功能、迁移、代谢、激活、增殖、TCR信号和转录因子相关的特征。作者还认为转录因子FOXP3和SUB1可能参与促进双途径的某些特征。这些发现丰富了人类T_reg细胞异质性、功能和分化的知识，并提供了一个单细胞分辨率图谱，这将有助于更好地理解T_reg细胞和T_reg细胞相关疾病，并对这些疾病进行治疗干预。