Nature子刊|辩证看待PD-1PD -L1免疫治疗标志物

        哈喽，好久不见，开门见山，今天小编向大家分享的是一篇发表在Nature子刊《Nature Communications》（IF:14.919）杂志上的文章，主要讲解了不同肿瘤类型对PD-L1阻断反应的分子决定因素。免疫检查点阻断可以说是近几年的明星课题，PD-1/PD-L1抑制剂免疫疗法也确实为很多患者带来了福音，但目前仍没有有效的预测生物标志物来指导临床精准用药。当所有人都搅破脑汁想要寻找新的预测生物标志物的时候，却有人独辟蹊径，不仅否定了别人找到的预测标志物，还推翻了自己千辛万苦的找到的预测基因签名。真可以说是学术圈的“杠把子”了，还杠出了一篇Nature子刊，赶快随小编一睹为快吧~

患者来源

从atezolizumab的三个II期临床试验中总共选择了366名患者进行分析。

①IMvigor210（NCT02108652）是一项关于atezolizumab用于治疗膀胱癌的II期临床试验，共招募了两组患者。第一组包括119名不适合顺铂化疗的晚期初治患者，使用atezolizumab进行一线治疗；第二组招募了316名铂类化疗失败的患者，使用atezolizumab进行二线治疗。本研究中选择是来自第二组中的208名转移性尿路上皮癌(mUC)患者。

②POPLAR（NCT01903993）是一项多中心、随机、开放、2期临床研究，旨在评估atezolizumab在含铂方案治疗进展后局晚期或转移性非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的疗效和安全性，纳入287例NSCLC患者，根据PD-L1在肿瘤浸润免疫细胞中的表达情况、组织学分型、继往治疗方式将这些患者随机分组。其中atezolizumab组144例，多西他赛(docetaxel)组143例。本研究选择的是来自atezolizumab组中的81名NSCLC患者。

③IMmotion150研究是在转移性肾细胞癌(RCC)患者中开展的第一项评估atezolizumab与贝伐珠单抗(bevacizumab)联用的疗效和安全性的多中心、开放标签II期研究，患者随机分为3组，A组给予atezolizumab+贝伐珠单抗治疗；B组给予atezolizumab治疗；C组给予舒尼替尼治疗。本研究选择的是来自A组或B组中的77名RCC患者。

结果展示

Part 1. PD-L1表达情况和肿瘤突变负担评估

通过免疫组化分别对肿瘤细胞（TC）和浸润免疫细胞（IC）中PD-L1表达水平进行评估。根据表达水平对细胞进行分级：0级(<1%)，1级(≥1%但<5%)，2级(≥5%但<50%)，3级(≥50%)，1、2或3级，均被归类为PD-L1阳性(≥1%)。

患者客观反应率（ORR）主要包括：反应[完全反应(CR)/部分反应(PR)]或无反应[稳定疾病(SD)/渐进性疾病(PD)]。

结果显示，在这3种肿瘤患者中均未观察到ORR存在显著差异。mUC、NSCLC和RCC客观反应率分别为21.6%（45/208）、13.6%（11/81）和19.5%（15/77）（补充图1b）。74.0%(154/208)的mUC、70.4%(57/81)的NSCLC和62.3%(48/77)的RCC肿瘤为PD-L1+（补充图1c）。在所有3种肿瘤中，应答者均表现出PD-L1阳性比例增加（图1a）。这种PD-L1评分方案灵敏度较高（83.1%），但特异性较低（32.2%）[mUC：84.4%/28.8%；NSCLC：90.1%/32.9%；RCC：73.3%/40.3%]。

为了评估肿瘤突变负荷（TMB）对检查点抑制剂疗法效果的预测能力，作者进一步选择了246个样本（144mUC、50NSCLC和52RCC）的全外显子测序结果进行分析（见补充图1a）。

结果显示，TMB在这3种肿瘤患者中存在显著差异，mUC患者(中位数17.7 mub./mb)和NSCLC患者(中位数15.5 mub./mb)的TMB显著高于RCC患者(中位数10.9 mub./mb)，这与TCGA中的数据结果一致(补充图1d)。mUC应答者的TMB显著升高，在NSCLC中也有同样趋势，但在RCC患者中应答者与非应答者之间的TMB无显著差异(图1b)。

根据中位数(16.3mu./mb)，进一步将样本分为TMB^high或TMB^low，TMB检测应答者的总体敏感性和特异性分别为70.6%和55.4% (mUC: 79.4%/47.3%；非小细胞肺癌:66.7%/56.1%；RCC: 37.5%/75.0%)，对mUC患者的灵敏度最高。

接下来，作者还联合分析了PD-L1和TMB的预测能力，结果显示，在总共检测的246例肿瘤中，PD-L1⁺和TMB^high合并的肿瘤有207例(84.1%)，其中51例来自应答者(图1c)。其中PD-L1⁺和TMB^high为31例(60.8%)，PD-L1⁺为10例(19.6%)，TMB^high为5例(9.8%)。另有5例(9.8%)患者同时患有PD-L1^-和TMB^low。作者认为联合使用PD-L1表达和TMB能够识别大部分应答者，具有较高的检测灵敏度。然而，PD-L1⁺和/或TMB^high肿瘤也包括161/195(82.6%)非应答者，所有肿瘤组均出现了假阳性和假阴性，表明这种检测方法的特异性较差。这提示我们肿瘤具有特异性反应机制，促使我们寻找新的生物预测标志物，以更准确地检测不同类型肿瘤的应答者。

Part 2. 肿瘤预处理后的转录景观

为了进一步分析PD-L1表达和TMB对免疫检查点的影响，作者通过RNA-seq分析预处理后的肿瘤转录组。结果显示，样本主要按肿瘤类型聚类(图1d)。在mUC和NSCLC肿瘤之间观察到重叠，而RCC肿瘤是离散聚集的，这可能是由于组织特异性和肿瘤发生机制不同综合影响的结果。这种聚类模式在TCGA和PCD4989g的两个独立数据集中也得到了确认(补充图2a)。

Part 3.免疫检查点抑制剂签名的预测性能

为了进一步寻找有效的生物预测标志物，作者希望能够通过机器学习建立一个可以预测肿瘤患者对atezolizumab反应的基因签名。通过366名患者的转录样本（训练集）作者得到了加权的58个基因签名(补充数据2)，同时在PCD4989g队列的206个样本（验证集）[mUC(n = 94)、NSCLC (n=54)、RCC(n = 58)]中进行验证（见补充图1a）。

结果显示，可以在训练集中显著区分应答者和非应答者(图2b)。在POPLAR的多西他赛组(NSCLC)和IMmotion150的舒尼替尼组(RCC)中，应答者和非应答者之间基因签名分数没有显著差异，说明该基因签名对atezolizumab应答具有预测价值(图2b)。

为了评估此签名对应答者接受atezolizumab治疗效果的预测能力，作者在训练集和验证集中都绘制了ROC曲线，同时还包括PD-L1、TMB的ROC曲线。

结果显示，在训练集中，这个基因签名在246个RNA-seq和TMB样本中具有很高的准确性(红色曲线，AUC=0.99)(图2c)，而TMB(黑色曲线，AUC = 0.69)和PD-L1(蓝色曲线，AUC = 0.60)的AUC均较低。有趣的是，在RNA-seq、PD-L1和TMB之间没有观察到协同作用，表明RNA-seq可以能够单独概括PD-L1表达和TMB的生物学基础。

此外，作者还绘制了其他5项已报道的预测因子的ROC曲线，均表现出糟糕的预测性能，最高AUC为0.60。

在验证集中，所有上述的预测因子都显示出较差的预测能力，包括作者提出来的58个基因的签名（图2d）。

为了提高结论的可靠性，作者在训练集和验证集上采用其他不同的机器学习算法进行了重新测试，都得到了相似的结果。这些发现表明，虽然机器学习方法可以通过单数据集的交叉验证来识别高度准确的签名，但独立数据集的验证仍然具有挑战性，可能会受到样本量低、肿瘤异质性以及不同队列之间临床差异的影响（补充图6）。

Part 4. PD-L1与TMB的转录相关物

接下来，作者分析了与atezolizumab反应相关的生物途径，建立了一个包括应答、肿瘤类型、PD-L1表达和TMB在内的模型。

首先鉴定了与PD-L1表达相关的基因，其中过表达基因1325个，低表达基因463个(补充数据3)。过表达基因主要为免疫相关基因，包括IFN-γ诱导的趋化因子(CXCL9, CXCL10, CXCL11和CXCL13)，检查点(CTLA4和IDO1)，以及细胞毒性编码基因(GZMA, GZMB, GZMH, GZMK和PRF1)和B/浆细胞生物学(CD79A, JCHAIN, IGLL5, MZB1, TNFRSF13B和BLK)。

同样，作者比较了TMB^high和TMB^low肿瘤的转录组差异，其中165个基因过表达，121个基因低表达，表明TMB与转录之间的相关性较PD-L1弱(补充数据4)。

结果表明，PD-L1表达对RNA-seq在肿瘤中的转录差异贡献最大，并且与PD-L1水平相关的基因代表了肿瘤免疫浸润的特征。PD-L1和TMB的转录相关物大多是不同的，支持这两个生物标志物之间的不重叠特征。

Part 5. PD-L1阻断反应的转录相关物

接下来，作者探索了基因表达和atezolizumab反应之间的关系。由于TMB对肿瘤转录组影响较小，因此将TMB从模型中去除。

结果显示，在联合分析中(图3a)，应答者肿瘤中ATP生物合成和氧化磷酸化丰富。细胞周期蛋白相关/ DDR(DNA损伤修复)相关基因在mUC和NSCLC肿瘤中富集，可能反映了TMB增加与PD-L1阻断反应之间的关系。相反，与肿瘤生物学(WNT和PI3K-Akt)和基质生物学(TGF-β、胶原和细胞外基质)相关的模块在非应答者中富集。

随后作者分别对PD-L1⁺和PD-L1^-肿瘤进行分析，发现根据PD-L1状态，不同肿瘤的转录组存在显著差异。在PD-L1⁺ mUC肿瘤中，只有凋亡信号与应答相关。PD-L1⁺ NSCLC转录组则以翻译途径为主。在PD-L1+ RCC肿瘤中，髓系炎症、WNT信号传导和胶原形成与ORR呈负相关(图3b)。

有趣的是，在107例PD-L1肿瘤中，在3种不同肿瘤中观察到了一致的转录信号，即细胞周期/DDR(DNA损伤修复)与PD-L1肿瘤的应答呈正相关(图3b)。虽然表明在这种情况下高TMB对阻断反应有贡献，但DDR特征和TMB之间的相关性不大(补充数据6)。

Part 6. PD-L1阻断反应中CDKN2A活性增加

在与PD-L1阻断反应相关的基因中，CDKN2A上调最多(图4)。CDKN2A编码p16(INK4A)，它是细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4和CDK6的内源性抑制剂，可阻止G1/S期转变并诱导细胞衰老。在许多肿瘤类型中，存在CDKN2A的拷贝数丢失。

为了评估mUC、NSCLC和RCC中CDKN2A缺失的患病率，作者查询了Foundation Medicine临床数据库，其中包括140288例患者肿瘤样本，以了解部分(1拷贝，CN1)或完全(0拷贝，CN0) CDKN2A缺失患者的患病率。结果显示，在某些癌症中显示频繁的CDKN2A丢失(图4b)，包括膀胱癌(39%)、RCC(36%)和非鳞状细胞癌(34%)。

接下来，作者评估了CDKN2A拷贝数改变和PD-L1阻断反应之间的关系。结果发现，在CDKN2A缺失的mUC和RCC中观察到患者对atezolizumab的应答降低，但这种相关性没有达到统计学意义，可能是由于样本量低(图4c)。

最后，作者分析了CDKN2A及其两个靶点CDK4和CDK6的转录水平与mUC和NSCLC的总生存(OS)以及RCC的无进展生存(PFS)之间的关系(图4d)。结果显示，CDKN2A增加与mUC中OS改善相关，RCC患者的PFS也有改善趋势。相反，CDK6的增加与mUC和NSCLC的OS以及RCC的PFS降低相关，而CDK4表达高低对患者生存的影响无显著性差异。

讨论

        在这项研究中，作者通过RNA-seq对366名患者的PD-L1表达和TMB进行转录分析，以确定在三种对抗PD-L1单克隆抗体atezolizumab有反应的肿瘤类型中与检查点抑制剂(CPI)反应相关的分子程序。这项交叉指征分析结合了572名接受atezolizumab治疗的患者的现有生物标志物和RNA-seq，显示了mUC、NSCLC和RCC肿瘤之间显著的分子异质性。机器学习没有识别出一个统一的转录签名预测ORR。多种因素决定了对检查点阻断的反应，而这些因素在一定程度上依赖于肿瘤类型，这突出了在这一领域开发生物标志物的难度。虽然对PD-(L)1阻断反应的通用生物标志物可能存在，但考虑适应症特异性的分子环境来制定下一代联合治疗将是至关重要的。