近年来，肿瘤分子分型目前作为国家精准医疗战略的重点研究投入方向，也备受各大顶尖期刊的青睐，且相关研究多次产出高分文章，肿瘤分子的分型也重新定义了对这种癌症的进一步研究，包括发展模型，改善诊断和预后，以及确定更具体的治疗方法。所以，这样的文章很难不火，接下来就和小编一起来解读一篇今年9月22日发表在《nature communication》上的一篇关于多组学研究识别视网膜母细胞瘤亚型的文章，希望为大家的课题提供思路，少画饼干实事！

摘要:

视网膜母细胞瘤是一种罕见的儿童视网膜癌，发病率约为17000例活产儿中1例，但它是最常见的儿童眼内恶性肿瘤。视网膜母细胞瘤的主要治疗目标是通过早期发现和治疗、防止转移性扩散，首先挽救儿童的生命。我们通过对102例视网膜母细胞瘤的转录组、甲基组和DNA拷贝数改变数据的综合分析，确定了与不同临床和病理特征(诊断时的年龄、侧变性、遗传和生长模式)相关的两种亚型。多组学方法的使用使我们可靠地鉴定了两种主要的视网膜母细胞瘤分子亚型。同时，这两种亚型不同的分子、病理和临床特征突出了这种分类的相关性，与亚型2肿瘤相关的高干性和神经元特征将视网膜母细胞瘤与新兴的癌症研究领域联系起来，为治疗开辟了新的机会。

结果：

两种具有明显临床和病理特征的视网膜母细胞瘤分子亚型的鉴别

研究人员分析了102个去核的视网膜母细胞瘤，为了研究不同的视网膜母细胞瘤分子亚型的存在，研究人员结合了3种基因组方法，mRNA表达，DNA甲基化和体细胞拷贝数改变。在这三个组学数据集中，计算样本的多个分区k集群（图a）,针对各种k值,通过无监督层次聚类，大多数肿瘤可归属于两个亚型之一(38/亚型1,58/亚型2)。然后比较了这两个亚型的临床和病理特征发现，亚型1肿瘤患者在诊断时明显更年轻(中位年龄=11.0 vs 23.9)。并且视网膜母细胞瘤通常表现为外生性生长(进入视网膜下间隙)，内生生长(向玻璃体方向)，或较少见的混合生长模式(内生和外生性)。亚型1肿瘤明显更多是外生的，而亚型2肿瘤大部分是内生的。亚型2肿瘤中坏死区域比亚型1肿瘤中更常见。肿瘤直径和组织学危险特征(视神经侵犯、脉络膜或巩膜侵犯)在两种亚型之间没有显著差异。

亚型2比亚型1对比，表现出更多的遗传改变

研究人员研究了这两种肿瘤亚型的基因组特征，通过确定它们的人类体细胞突变谱，除了视神经母细胞瘤常见的1q, 2p (MYCN)， 6p, 13q的增加和13q (RB1)以及16q的损失/缺失（图a），在亚型2中我们可以明显的观察到1q增益、2p增益和16q损失/LOH在亚型2样本中明显更频繁(图a)。MYCN扩增从拷贝14到拷贝246不等。且在排除MYCN扩增时，亚型2拷贝数变异的基因组比例显著高于亚型1（图b）。全外显子测序检测到的亚型2的体细胞突变数量显著高于亚型1(图c)。由于RB1、BCOR和ARID1A三个基因被发现反复突变。所以研究人员对31个缺乏全外显子测序数据的样本中的23个进行了这三个基因的靶向测序。RB1、bbcor、ARID1A突变、MYCN扩增、1q增益和16q损失的分布如图中的亚型所示。无论其亚型如何，大多数肿瘤均存在RB1突变，且两种肿瘤亚型间突变类型无差异。值得注意的是，亚型2发现了一个没有RB1改变的肿瘤，并显示了高水平的MYCN扩增(141拷贝)。BCOR突变仅在亚型2中发现，两个ARID1A突变也是如此。大多数没有MYCN扩增的亚型2肿瘤表现出1q的增加和16q的损失。相比之下，除一例MYCN扩增肿瘤外，没有一例MYCN扩增肿瘤有1q增益或16q损失（图d）。CpG岛(CpG island)：CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常概率。CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域，约有60%以上基因的启动子含有CpG岛。CpG岛的GC含量大于50%，长度500~1000bp。在图e中，显示了6607个差异甲基化cpg的热图。与亚型1相比，亚型2肿瘤在CpG岛内表现出更频繁的高甲基化，在CpG岛外表现出更频繁的低甲基化，4种mycn扩增的亚型2肿瘤在CpG岛外表现为低甲基化，而在CpG岛内不表现为高甲基化（图f）。

这两种亚型在锥体和神经节/神经元标记的表达和干性特征的表达上存在差异

研究人员比较了两个亚型的转录组。几乎有三分之一的基因在两个亚型之间有锥体差异表达，锥体标记物在亚型1肿瘤中过表达，而神经元/神经节标记物在亚型2肿瘤中过表达(图a)。在已知参与视网膜母细胞瘤的基因中，有31个被发现在两种亚型之间有差异表达，这些基因中的一些位于扩增/扩增区(KIF14和MDM4位于1q32.1, MYCN位于2p24.3)，或丢失(RBL2位于16q12.2)染色体区域，而其他基因则参与MYC/MYCN通路(MIR17HG, SKP2)。通过对6207个基因进行层次聚类分析，确定了3个主要基因簇:2个亚型中上调基因簇(1.1基因簇由1201个基因组成，1.2基因簇由1788个基因组成)和1个亚型中上调基因簇(3112个基因组成)(图b)。接下来研究人员对三个基因簇进行了基因富集分析（图c）。亚型2中缺乏炎症/免疫标记和MYC和E2F靶基因的富集引起了干性特征，基于转录组数据，我们将四种不同的干性标志应用于59个有转录组学数据的视网膜母细胞瘤样本。我们还评估了干细胞干性指数和各种免疫细胞丰度之间的关系，根据微环境细胞群(MCP)计数器评分进行估计。干性指数与单核细胞系、B系和细胞毒性淋巴细胞的MCP评分呈负相关(图d)。结论得出，亚型2与高干性相关。同时，在分析的24个神经节细胞标志物中，一小部分(EBF3, EBF1, GAP43, POU4F2, NEFM, ALCAM, NRN1, CNTN2)在亚型2肿瘤中一致过表达，在亚型2肿瘤这些基因过表达可以被认为是神经节和神经基因（图e）。这些观察表明亚型2可能是锥神经元亚型。神经元基因的表达不仅存在于脑和神经内分泌肿瘤中，也存在于一些上皮性肿瘤中(乳腺、卵巢、结肠癌)65。近年来，肿瘤细胞利用神经和神经发育途径增殖、迁移，并与包括内皮细胞和神经元在内的正常细胞相互作用的研究已经变得很清楚。因此，在亚型2肿瘤中发现的神经元基因的过度表达可能与这些肿瘤的侵袭性有关。

锥体细胞分化状态和神经元/神经节细胞标记物的表达可以区分这两种亚型

在两种亚型的视网膜母细胞瘤中观察到的圆锥体标记物的表达与视网膜母细胞瘤的起源细胞是一致的。研究人员测量了在视网膜锥标记瀑样在不同时间点后人类诱导多能干细胞的分化成视网膜早期和晚期的表达水平,亚型1 (n = 23)和亚型2 (n = 44)视网膜母细胞瘤正如预期的那样，在诱导多能干细胞衍生的视网膜类器官中，早期光感受器/锥细胞标记物(OTX2, CRX, THRB, RXRG)的表达出现在较早的时间点，而晚期锥细胞标记物(PDE6H, GNAT2, ARR3, GUCA1C)则出现在较早的时间点。GUCA1C是最后一个表达的标记物，这与之前相关研究体外和体内的观察结果一致。结果表明，亚型1肿瘤对应的锥体发育阶段比亚型2肿瘤更分化。由于几种神经元/神经节细胞谱系相关基因在肿瘤亚型之间存在差异表达，研究人员还比较了它们在视网膜类器官和两种亚型肿瘤样本中的表达水平，与亚型1相比，亚型2中的这些神经节标志物上调(图a)。图b显示了亚型1和亚型2肿瘤细胞锥体每个时间点视网膜的诱导分化后,每个肿瘤亚型的质心之间的相关系数和瀑样图；为了说明每个亚型的视网膜母细胞瘤的视锥体分化程度，我们使用光感受器/视锥标记物表达，结合分化诱导后不同时间点的视网膜器官样本和视网膜母细胞瘤样本，生成了一个系统发育树(图c)。为了进一步探讨视网膜母细胞瘤中视锥细胞分化的异质性，研究人员还通过免疫组化研究了早期光感受器标记物(CRX)和晚期视锥细胞特异性标记物(ARR3)的分布。还检测了神经节细胞标记物(EBF3)的表达。

亚型2肿瘤细胞内异质性的单细胞分析

为了进一步探讨亚型2肿瘤的肿瘤内异质性，我们对亚型2肿瘤进行了单细胞RNA测序。免疫组化分析显示ARR3和EBF3相互排斥表达，定义了两种类型的区域在约30%的亚型2肿瘤中观察到。研究人员在质控之后保留了1198个细胞的转录组，并通过单细胞聚类分析得到了7个聚类并通过簇标记物表达进行了单细胞亚群的识别，每一簇标记物表达的可视化如图所示（图a-e），通过单细胞分析方法对亚型2 肿瘤的细胞内异质性进行了分析。

亚型2肿瘤与较高的转移风险相关

研究了视网膜母细胞瘤转移是否属于一个特定的分子亚型。在最初的102例视网膜母细胞瘤病例中，没有患者发生转移。因此，研究人员研究了另外112例在诊断时具有高危病理特征的原发肿瘤，其中19例随后发生转移。TFF1在正常发育的视网膜中未表达。在亚型2肿瘤中，与亚型1肿瘤相比，它是最高上调基因,表达在大多数肿瘤亚型2但很少或根本没有在亚型1肿瘤中表达。研究人员通过免疫组化评估了TFF1蛋白是否表达在最初的102个分类的视网膜母细胞瘤中，其中55个肿瘤发生了TFF1表达(18个亚型1和37个亚型2)。图a显示了具有代表性的亚型1和亚型2肿瘤中TFF1、CRX和ARR3的表达。亚型1肿瘤显示很少或没有TFF1的表达，而大多数亚型2肿瘤表现出高水平的表达（图a-b）。在随后发生转移的19例原发肿瘤中，有18例可检测到TFF1表达。18例TFF1阳性都不是非转移性病例（图b）。这表明他们属于亚型2。与此一致的是，16例转移性病例中有15例EBF3阳性，是亚型2特异性相关的神经节标记物。所有这些结果都表明了，亚型2肿瘤比亚型1肿瘤更具侵袭性。

文章小结：

到这里文章就结束了，多组学方法的使用使我们可靠地鉴定了两种主要的视网膜母细胞瘤分子亚型。这两种亚型不同的分子、病理和临床特征突出了这种分类的相关性，锥样和锥/神经元两种分子亚型的鉴定代表了对视网膜母细胞瘤认识的重大进展。重新定义了对这种儿童癌症的进一步研究，包括发展模型，改善诊断和预后，以及确定更具体的治疗方法。与亚型2肿瘤相关的高干性和神经元特征将视网膜母细胞瘤与新兴的癌症研究领域联系起来，对于临床治疗有着重要的指导意义。