Oncogene|干湿结合又能蹭热点，就这么干！

哈喽，大家好，好久不见~往期呢，小编总是喜欢分享一些高分的纯生信分析文章，因为小编觉得咱们不用花费高昂的实验费用，就能发表高分的文章，靠手艺吃饭，何乐而不为呢？（其实是因为小编实在囊中羞涩，又没有大佬支持做实验，不得已而为之啊，流了一把辛酸泪）。不过话说回来呢，生信分析是工具，如果能够借助生信分析发现值得深入研究的科学问题，再进行基础实验验证，就是我们所说的“干湿结合”啦！文章的含金量妥妥上升n个档次！今天分享的就是一篇今年11月16日发表在Oncogene(IF:9.867)杂志上的非常经典的“干湿结合”文章《Smoking-associated upregulation of CBX3 suppresses ARHGAP24 expression to activate Rac1 signaling and promote tumor progression in lung adenocarcinoma》，一起欣赏吧~

数据来源

1）TCGA：https://portal.gdc.cancer.gov/

2）GEO：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/

3）CPTAC：https://proteomics.cancer.gov/programs/cptac

4）CancerSEA：http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/

5）hIP-Atlas：https://chip-atlas.org/

实验技术

1）细胞活力测定：MTS实验和菌落形成实验

2）Western Blot：蛋白质印迹分析

3）Co-IP：免疫共沉淀

4）RT-qPCR：实时荧光定量PCR

5）ChIP：染色质免疫沉淀

6）ChIP-qPCR：染色质免疫沉淀-荧光定量PCR

7）IHC：免疫组化分析

8）PLA：邻位连接测定技术

9）动物模型：异种移植

实验结果

一、CBX3 在当前吸烟的 LUAD患者中上调，CBX3 过表达预测 LUAD 患者的生存率更差

从分子特征数据库（MSigDB）中鉴定出参与组蛋白甲基化相关生物过程和信号通路的基因（n=347）（图1a）。通过单变量Cox回归分析，在TCGA-LUAD数据集中鉴定出22个基因与LUAD患者的无复发生存期（RFS）相关。重复运行1000次的Lasso-Cox回归分析进一步表明，CBX3和TAF9是LUAD患者中与RFS相关的两个关键基因（图1b）。然后，作者结合了TCGA-LUAD和TCGA-LUSC数据集的转录组数据，发现在两个数据集中，当前吸烟组的CBX3表达水平明显高于既往吸烟组（图1c），而TAF9并没有出现这种现象。CBX3的低表达水平主要集中在TCGA-LUAD数据集中的既往吸烟者和从不吸烟者中（图1d）。Kaplan-Meier生存分析表明，在TCGA-LUAD和GSE68465数据集中，高CBX3表达水平与较差的RFS和总生存期（OS）相关（图1e-h）。此外，与TCGA-LUAD和CPTAC-LUAD数据集中的肿瘤邻近组织相比，CBX3在肿瘤组织中显著上调（图1i，j）。 同样地，通过IHC染色，作者发现与肺腺癌（n=59）相比，CBX3在非肿瘤肺组织（n=8）中下调（补充图1a，b和表S5）。

二、CBX3促进LUAD细胞生长和侵袭

由于LUAD的单细胞序列表明CBX3可以调节细胞周期，增殖，侵袭和转移（图2a和补充图2a），作者进一步探索了CBX3在LUAD细胞中的促癌作用。为此，作者使用两种不同的短发夹RNA（shRNA）沉默了A549和H1299细胞中的CBX3表达（图2b，c）。MTS实验和菌落形成实验表明，CBX3沉默降低了LUAD细胞的增殖能力（图2d-f），还抑制了A549和H1299细胞中的细胞侵袭（图2g）。相反，CBX3过表达增强了LUAD细胞中的细胞增殖和侵袭（图2h-k，补充图2b）。此外，在A549细胞中敲低CBX3后，再挽救细胞中CBX3的表达，重新增强了细胞在体外和体内的增殖（图2l-p，补充图2c）。总之，这些数据表明CBX3在LUAD中充当癌蛋白。

此外，作者发现CBX3与LUAD吸烟患者之间存在密切关系。接下来，作者研究了CBX3在吸烟相关LUAD中的作用。A549细胞用shControl或shCBX3感染72小时。嘌呤霉素选择后，将细胞皮下注射到裸鼠体内。通过蛋白质印迹和RT-qPCR分析评估了CBX3的沉默效应（补充图3a，b）。然后，将每组小鼠随机分为三个亚组，这些亚组使用或不使用香烟烟雾提取物（CSE）（0.3ml/20g，ip）或尼古丁（0.5mg/kg，ip）处理（补充图3c）。结果表明CSE和尼古丁促进了shControl组的肿瘤生长（补充图3d-f）。然而，CBX3的敲低降低了CSE或尼古丁体内治疗诱导的肿瘤生长促进作用（补充图3d-f）。此外，根据每组裸鼠中氨亮氨酸转移酶（ALT），天冬氨酸转氨酶（AST），肌酐（CRE）或血尿素氮（BUN）的血清分析，发现通过shRNA转染敲低CBX3或用CSE或尼古丁对裸鼠的肝脏和肾功能没有影响（补充图3g-j）。总之，这些数据表明CBX3在调节吸烟相关的肺腺癌细胞生长中起作用。

三、CBX3 增加了 LUAD 中活性 Rac1 的数量

为了探索CBX3在LUAD中致癌作用的潜在机制，作者对本体组织和单细胞的转录组学数据进行了功能富集分析。基因富集分析显示，CBX3激活了大量组织（TCGA-LUAD和GSE68465）和A459和LC-2/ad单细胞（图3a-d）。CBX3敲低（GSE173858）后A549细胞的RNA-seq分析证实了CBX3在Rho GTPase信号传导激活中的作用（图3e，f），并表明CBX3下调了A549细胞中Rho GTPase信号传导的几个负调节因子（图3g）。一致地，CBX3沉默降低了LUAD细胞中活化的Rac1的水平（图3h，i）；Rac1被认为是Rho GTPase信号传导激活的指标。相反，CBX3过表达增加了A549和H1299细胞中的Rac1水平（图3j，k）。综上所述，这些数据表明CBX3在上调LUAD细胞中活性Rac1的量方面起着关键作用。

四、CBX3 对 LUAD 中ARHGAP24表达呈负性调节

接下来，作者探索了CBX3调节Rac1途径的分子机制，评估了CBX3水平与Rho GTPase信号传导调节器之间的相关性。ARHGAP24是TCGA-LUAD，GSE68465和CPTAC-LUAD数据集中唯一与CBX3水平呈负相关的Rho GTPase调节因子（图4a）。此外，LUAD标本中的ARHGAP24 mRNA和蛋白质水平低于非恶性组织（TCGA-LUAD数据集和CPTAC-LUAD数据集）（图4b，c）。有趣的是，低ARHGAP24 mRNA水平与LUAD患者的无病生存率和OS差有关（图4d，e）。

RNA-seq分析表明，在CBX3沉默后，ARHGAP24在A549细胞中上调（图4f）。此外，在不同的LUAD数据集（TCGA，GSE68465和CPTAC；图4g-i）。LUAD组织微阵列（包括59名LUAD患者的组织）用于评估CBX3和ARHGAP24的蛋白质水平（图4j）。根据转录组学数据，CBX3蛋白水平与LUAD组织中ARHGAP24蛋白水平呈负相关（图4k）。这些结果表明，CBX3对LUAD中的ARHGAP24表达呈负调节。

五、CBX3通过抑制LUAD细胞中的ARHGAP24表达间接增加活性Rac1的量

由于ARHGAP24被报道抑制Rac1途径，作者接下来评估了CBX3是否由于抑制ARHGAP24表达降低了失活率而上调了活性Rac1的水平。CBX3敲低增加了A549和H1299细胞中ARHGAP24的蛋白质和mRNA水平（图5a，b）。相反，CBX3过表达降低了A549和H1299细胞中的ARHGAP24 mRNA和蛋白质水平（图5c，d）。使用ChIP-Atlas的分析揭示了ARHGAP24启动子中的CBX3结合峰（图5e）。CBX3通过识别组蛋白H3K9三甲基化（H3K9me3）来抑制靶基因的转录，并且H3K9me3结合位点与ARHGAP24启动子区域中的CBX3结合位点重叠（图5f）。ChIP-qPCR分析显示，ARHGAP24的启动子中存在CBX3和H3K9me3（图5g，h），表明CBX3通过识别ARHGAP24启动子的甲基化来调节ARHGAP24的表达。此外，与在A549细胞中单独敲低ARHGAP24相比，ARHGAP24消融细胞中CBX3的过表达没有进一步提高活性Rac1的水平（图5i）。ARHGAP24和CBX3的Co-knockdown降低了CBX3沉默能力，从而间接减少Rac1失活（图5J）并抑制LUAD细胞的体外和体内生长（图5k-n）。这些数据表明，CBX3下调ARHGAP24从而增加活性Rac1的量并促进LUAD中的肿瘤生长。

六、CBX3与TRIM28，TRIM24或RBBP4结合以调节LUAD细胞中的ARHGAP24表达

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析显示，CBX3与各种蛋白质相互作用以调节许多细胞过程（图6a）。在这些蛋白质中，TRIM28，TRIM24和RBBP4与CBX3表现出最密切的关系（图6a）。有趣的是，免疫共沉淀显示CBX3与A549和H1299细胞中的TRIM28，TRIM24或RBBP4相互作用（图6b-e;补充图4a）。此外，作者进行了邻位连接测定（PLA）以确认A549细胞中CBX3与TRIM28，TRIM24或RBBP4之间的相互作用（补充图4b）。此外，免疫荧光测定显示CBX3与TRIM28，TRIM24或RBBP4在A549细胞中共定位（补充图4c）。TRIM28和TRIM24属于相同的TRIM蛋白质亚家族，含有溴结构域。作者发现缺乏溴结构域的TRIM28突变体无法与A549细胞中的CBX3结合（补充图5a），这表明CBX3可能通过其溴结构域与TRIM28相互作用。由于溴结构域识别二乙酰化蛋白，作者分析了CBX3的氨基酸序列，并确定了用于乙酰化的共识FBP1或TWIST1基序（补充图5b）。 与野生型CBX3相比，CBX3 K81R/K84R（KR）突变体的表达降低了CBX3和TRIM28之间的相互作用（补充图5c），并进一步下调了ARHGAP24（补充图5d-f）。另一方面，TRIM28、TRIM24和RBBP4的敲低增加了ARHGAP24表达（图6f-k;补充图5g-i）。此外，作者发现LUAD样本中ARHGAP24与TRIM28，TRIM24或RBBP4的水平呈负相关（补充图5j-l）。缺乏溴结构域的TRIM28突变体的表达不影响ARHGAP24在A549细胞中的表达水平（补充图5m）。文献报道RBBP4与PRC组分一起催化组蛋白H3的三甲基化。因此，作者评估了CBX3是否可以结合TRIM28，TRIM24和RBBP4来调节ARHGAP24表达。对ChIP-seq数据的分析显示，ARHGAP24的启动子中存在TRIM28，RBBP4，TRIM24，CBX3和H3K9me3的共同结合区域（补充图6a）。ChIP-qPCR分析证实了TRIM28，TRIM24和RBBP4与A549和H1299细胞中ARHGAP24启动子的结合（图6l-n;补充图6b-d）。此外，TRIM28、TRIM24或RBBP4的敲低降低了CBX3与A549细胞中ARHGAP24启动子的结合（图6o-q）。相反，是野生型TRIM28而不是缺乏溴结构域的TRIM28的过表达增强了CBX3与ARHGAP24启动子的结合（补充图6e）。此外，在A549细胞中共敲低CBX3之后，由过表达或TRIM28诱导的ARHGAP24表达水平的降低以及由TRIM28，TRIM24或RBBP4的敲低引起的ARHGAP24表达水平的上调并不明显（图6r-t;补充图6f-j）。此外，作者还发现，TRIM24或RBBP4的敲低与TRIM28沉默相结合，不能进一步明显增强ARHGAP24在A549细胞中的表达（补充图6k-p），这表明TRIM28是调节ARHGAP24表达的最重要因素。综上所述，这些数据表明CBX3与TRIM28，TRIM24或RBBP4形成复合物以调节LUAD中的ARHGAP24表达。

总结

在这项研究中，通过对参与组蛋白甲基化的基因进行分析，作者发现组蛋白H3K9甲基化阅读器CBX3的表达在当前使用LUAD的吸烟者中上调。还确定了CBX3是LUAD进展的关键介质。作者对公开可用数据集的生物信息学分析和来自LUAD细胞的RNA-seq数据表明，CBX3调节LUAD细胞中的Rho GTPase信号通路。还发现，CBX3与RBBP4，TRIM28和TRIM24联合，抑制ARHGAP24的表达，从而上调活性Rac1的量，最终促进肺腺癌的进展。尽管如此，这三种蛋白质如何与CBX3复合物调节LUAD进展的具体机制仍然未知。

总之，作者的研究结果表明，CBX3在当前吸烟的LUAD患者中上调。CBX3过表达促进LUAD细胞增殖和侵袭，并导致LUAD患者的生存结局较差。CBX3的这种致癌作用通过ARHGAP24 / Rac1途径介导。数据还表明，TRIM28，TRIM24和RBBP4调节LUAD中的CBX3 / ARHGAP24轴（图7）。这些发现强烈表明，CBX3 / ARHGAP24 / Rac1轴在吸烟诱导的LUAD中起关键作用。

参考文献：
Jin X, Zhang B, Zhang H, Yu H. Smoking-associated upregulation of CBX3 suppresses ARHGAP24 expression to activate Rac1 signaling and promote tumor progression in lung adenocarcinoma. Oncogene. 2021 Nov 16. doi: 10.1038/s41388-021-02114-8. Epub ahead of print. PMID: 34785774.