1. 概述

随着分析生物学、微流控技术和生物信息学的发展，已使研究恶性肿瘤中数千甚至数百万个细胞的单细胞分辨率成为可能。肿瘤和相关免疫细胞及基质细胞的基因组、转录组、表观基因组和蛋白质组特征的高维、多面表征使肿瘤异质性、肿瘤细胞和它们的微环境之间的复杂相互作用以及每个肿瘤进化轨迹的细节得以解剖。来自美国的研究人员在《Nature Reviews Clinical Oncology》发表了Applying high-dimensional single-cell technologies to the analysis of cancer immunotherapy文章。在该文章中，首先阐明了单细胞的转录组、蛋白质组、表观基因组和基因组技术是如何改变我们对抗癌免疫治疗的反应性和耐药性的理解，并探索整合多种模式的分析方法。然后说明了单细胞T细胞受体(TCR)分析的重要性，并重点调查了单细胞空间组学分析与适用性免疫肿瘤相关的新兴技术。最后，讨论了单细胞技术的未来发展方向，以及它们在促进免疫肿瘤领域的发展中可能发挥的作用。

2. 单细胞组学

2.1 单细胞转录组

单细胞RNA测序(Single- cell RNA sequencing, scRNA-seq)是指一组技术，可以对单个细胞中的转录本进行非靶向定量。单细胞转录组scRNA- seq可识别新的细胞类型、研究罕见的细胞群、并定义细胞状态和系统发育谱。图1给出了肿瘤免疫单细胞分析工作流程。

2.2 肿瘤细胞和免疫治疗反应

无论是在肿瘤之间还是在个体肿瘤内部，癌症的异质性是scRNA-seq分析肿瘤细胞突出的主要特征。当患者的多个恶性细胞聚集在一起时，在胶质瘤、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌和卵巢癌等疾病中，单个细胞组的转录谱主要是由患者的自身决定的。这种患者-患者的异质性使得用单个肿瘤细胞的scRNA-seq分析来研究患者对治疗的反应变得复杂化。 因此，免疫细胞和基质细胞的单细胞分析应用于识别细胞类型和与患者之间共享的免疫治疗反应相关的状态时更加富有成效。

2.3 免疫和基质细胞及免疫治疗反应

这一领域的重点是在非恶性组织中创建详细的细胞免疫图谱，然后将这些图谱和方法应用到肿瘤环境中。例如，Szabo等通过分析来自肺、淋巴结、骨髓和血液的50000个静止的和激活的T细胞所绘制的人类非恶性T细胞激活参考图。

在免疫治疗的背景下，将基于scRNA-seq分析的免疫肿瘤学方法(Table1)应用于TME中的免疫和基质细胞，能够阐明转录状态，这是免疫治疗(如ICIs)的反应和抵抗的基础。同时，单细胞转录组学与蛋白水平的结合，可以为新的免疫疗法提供新的共表达靶点 。

2.4 相互作用分析

通过将配体受体对在不同细胞类型之间的表达关联起来，可以从scRNA-seq数据推断出这些重要细胞间相互作用的信息。例如:肿瘤相关的树突状细胞和外周血T细胞之间的相互作用。该研究涉及16例初始肝细胞癌患者，使用scRNA-seq分析肿瘤、邻近肝脏、肝淋巴结、血液和腹水中的白细胞。谱系分析显示一种新型的LAMP3⁺ DCs能够从肿瘤转移到淋巴结。这些LAMP3+ DCs树突状细胞表达了许多可能的抑制性配体受体对，并与多个T细胞亚群相关，提示其在促进T细胞凋亡中的作用以及外周血T细胞的功能障碍。

2.5 scRNA- seq的局限性。

首先，scRNA-seq数据本质上是嘈杂的，因为真核生物的转录并不是以相同的基础速率进行。

其次，仅使用转录组数据来建立基因型和表现型之间的相关性仍然具有挑战性。除了scRNA-seq的一些固有限制之外，与样本采购和处理相关的具体细节也可能混淆结果。scRNA-seq依赖于可存活的单细胞悬液，但通常从外周血或淋巴结中获得，很难从实体肿瘤组织中获得。分离方法和低温保存条件的差异也会引起相当大范围的转录组变化。为了解决这些问题，研究人员开始制定规范组织分离和单细胞悬浮液制备的方案，其中单核RNA测序(snRNA-seq) 适用于许多不同的组织类型，与冷冻样本兼容，有时可以提供比scRNA- seq更少的细胞覆盖。

最后，批次效应。尽管已有多种方法来矫正这种批次效应，但存在掩盖真实生物差异的风险。

3. 蛋白质组学

3.1 大量细胞计数方法

一般在使用质谱进行蛋白质的非靶向检测缺乏与单细胞分析相关的足够的灵敏度,因此，单细胞蛋白质组学的研究主要依赖于使用抗体或类似的亲和试剂(如附着体或适配体)对目标的选择性检测。流式细胞术是研究人员在单细胞水平上评估蛋白表达的主要手段，但检测的抗原表位数量受到荧光团光谱重叠的限制。金属同位素标记抗体的大规模细胞检测技术的出现，大大增加了可以同时分析的标记的数量，从而能够对单细胞上表达的蛋白质进行高维检测。

3.2 单细胞蛋白质组分析的新兴技术

下一代光谱分析仪的出现有望扩展基于荧光的流式细胞术的能力，达到与大规模细胞术竞争的水平。这些系统相对于流式细胞术的一个优势是能够利用现有的大量荧光标记抗体，因为它们不像流式细胞术那样破坏细胞，可以为后续的实验进行分类和分离细胞。如：用条形码寡核苷酸而不是荧光团或重金属离子标记抗体，消除了对同时可分辨目标数量的限制。

其他抗体靶向的单细胞策略包括基于组织的细胞术(Box 1)，这增加了空间分辨率的提高水平，以及微流控细胞术，其中细胞被固定在微流控芯片上，而不是在流式中分析。芯片细胞术可以反复染色;在相同的细胞样本上，可以检测和量化标记的分数。单细胞条形码芯片技术，则用于检测单细胞所分泌的蛋白质。

3.3 基因组学方法

全基因组和全外显子组测序的许多方法还没有过渡到高维分析，这在很大程度上是因为这种测序的高成本妨碍了将每个患者的细胞数量扩大到相当大的数量。一种将微流体与融合液滴相结合的Tapestri系统成为了一种更有效的方法。首先使用大量肿瘤DNA样本的深度测序来识别sSNVs，然后使用单细胞DNA定向测序来检测导致癌变的体细胞突变或结构的突变。

3.4 表观基因组分析方法

结合高通量测序技术的靶向开放染色质测序(ATAC-seq)、免疫共沉淀测序(ChIP-seq)、亚硫酸氢盐DNA甲基化测序以及染色体构象捕获(如3C和Hi-C) 都已适用于单细胞分析。在多种方法中，单细胞(sc)ATAC-seq是目前唯一具有足够高吞吐量的方法，因此被广泛采用 。单细胞表观基因组学是一个快速发展的领域，特别是当与单细胞转录组学结合时，很可能是肿瘤学单细胞分析的下一个主要进展之一。用于单细胞DNA甲基化分析的亚硫酸氢盐测序，以及单细胞ChIP-seq的CUT&Tag等，这些方法将进一步扩展在单个细胞水平上分析表观遗传变化的能力。

3.5 RNA、DNA和蛋白质。

将单细胞蛋白质检测纳入scRNA-seq协议的技术(如CITE-seq和REAP-seq)使用抗体与条形码寡核苷酸结合，使通过scRNA-seq的cDNA测序步骤能够检测基于蛋白质的标记物。从而使蛋白质检测没有光谱重叠或可分解金属离子数量的限制。在非靶向转录组分析中加入基于抗体的检测数十到数百种蛋白质的能力，以及通过在传统免疫学框架内定义转录组，可以减少因转录缺失而引起的歧义，从而大大提高评估TME的能力。使用寡核苷酸标记的抗体也已被纳入Tapestri的工作流程，用于单细胞DNA测序，提供了连接基因型和表型的直接方法。

3.6 谱系追踪

scATAC-seq能够同时测量细胞系(通过线粒体基因组)和细胞命运(通过核表观基因组)，线粒体突变也可以在scRNA-seq数据中检测到，但没有scATAC-seq数据稳定，因为线粒体基因组的覆盖率较低且不一致。这种谱系追踪分析在未来可以应用于更好地了解哪些肿瘤细胞克隆在对特定治疗的反应中扩张或收缩，从而可以知道哪些克隆可能与治疗抗性有关。

3.7 单细胞T细胞受体分析

T细胞是适应性免疫系统的主要部分，负责抗肿瘤免疫，因此是FDA批准的大多数癌症免疫疗法(如ICIs、过继细胞疗法、肽或RNA疫苗、基于细胞因子的疗法和溶瘤病毒疗法)的主要重点。

TCR是一种由两条链组成的异源二聚体，基因重组可产生多种TCR序列。大多数T细胞(95%)携带单个TCR的α和β亚基，它们共同识别同源肽MHC抗原。基于这种TCR-肽-MHC的相互作用，免疫原性肿瘤中出现的TILs具有消除肿瘤的潜力。单细胞方法还可以识别成对的α和β TCR亚基，这是确定浸润性T细胞特异性的关键一步。这些信息可能不仅有助于解释对当前免疫疗法的耐药性(如肿瘤特异性的缺乏)，而且还有助于发现高活性的抗肿瘤TCR，这些TCR可用于新的工程TCR细胞疗法。

整合scRNA-seq和scTCR-seq提供了一种特别有效的方法来分析免疫治疗过程中免疫细胞的表型和功能特征。通过对T细胞的单细胞表型分析(如通过scRNA-seq)与识别它们各自的TCR克隆型相补充，这些综合方法为免疫细胞分析增加了T细胞抗原特异性的关键信息，从而能够更好地解剖抗原特异性T细胞在免疫治疗反应中的作用。此外，在免疫治疗过程中纵向收集的血液样本中，对扩大的TCR克隆进行非侵入性识别，可能会为肿瘤中临床相关TCR的识别和功能提供见解。

4. 高维空间分析技术

肿瘤免疫微环境的空间变异性越来越被认为是导致大多数癌症类型的异质性和可变治疗反应的原因。免疫组化、免疫荧光蛋白选择性免疫染色、核酸原位杂交已经成为癌症诊断、分类、治疗选择和预后不可缺少的空间方法（详见BOX1）。

5. 未来的方向

尽管免疫疗法已经改变了许多晚期恶性肿瘤的治疗方法，但大多数患者要么对相关药物无反应，要么最终产生耐药性。数以千计的临床试验联合免疫治疗方法使得免疫和非免疫治疗药物都已经完成或在进行中。但设计合理的免疫疗法——包括克服原发性或获得性、耐药性的组合将需要对每种癌症类型的肿瘤免疫微环境进行综合表征，并详细了解在治疗的背景下有效的抗肿瘤免疫的决定因素。单细胞技术能够对TME进行全面的分析，因此特别适合于研究肿瘤和免疫细胞的异质性，以及这种肿瘤生物学上的差异如何导致治疗耐药性。

为了有效地利用单细胞技术来提高我们对免疫治疗反应和耐药性机制的理解，并帮助开发新的治疗方法，临床试验将必须以一种可行的方式纳入单细胞方法。利用数据丰富的单细胞信息和生物信息学算法，将大量RNA-seq数据映射到由scRNA- seq和相关技术定义的细胞类型上。高维单细胞技术可以更容易地应用于临床，包括那些扩展传统方法信息内容的技术，如免疫组化和流式细胞术。对于来自血液恶性肿瘤和其他容易分散到单个细胞的样本，结合荧光标记物的大规模细胞术和流式细胞术已经开始成功。

6. 结论

单细胞RNA测序和相关模式正日益成为表征免疫治疗反应和耐药性的重要研究工具。此外，需要单细胞TCR分析来确定T细胞抗原的特异性，并提供适应性免疫系统在肿瘤形成、生长和治疗中的作用的关键信息。单细胞分析的下一个前沿是将高维含量与精确的组织定位相结合。高维单细胞分析的临床应用包括识别免疫治疗反应的高维生物标记物，能够细化批量测序数据的分析，并理解TME中复杂的细胞空间相互作用，从而驱动免疫治疗的反应。考虑到可能的免疫治疗基质的不断增加，以及肿瘤异质性和治疗性耐药性的个性化特性，癌症治疗的未来是联合治疗。因此，多维的生物标记将是为每个癌症患者做出最佳治疗选择的关键，而高维单细胞技术在免疫肿瘤学中将提供所需数据的分辨率和丰富性。

参考文献

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