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如何用生信分析解读单个分子？
今天给介绍一篇发表在期刊: Oncoimmunology的文章，该期刊在最近一年的影响因子为 8.11，比上一年增加了2.241分。该篇文章最大的特色是讲重点放在一个具体的分子上，值得我们学习。
转移和免疫抑制是口腔鳞状细胞癌(OSCC)预后不良的原因之一。YKT6是可溶性NSF附着蛋白受体(SNARE)家族的成员，其在口腔鳞癌中的作用尚不清楚。
WGCNA将红色模块确定为关键模块，并对红色模块中的基因进行了功能鉴定
模块性状相关热图显示，口腔鳞癌中红色模块与PN分期和CD8+T细胞浸润高度相关(Figure 1a)。这意味着红色模块中的基因可能是OSCC恶性肿瘤和预后的原因。因此，红色模块被确定为关键模块。生物过程分析表明，红色模块中的基因在细胞外基质的组织、转化生长因子-β受体信号通路的调控以及细胞外信号转导等过程中都得到了丰富的表达。KEGG通路分析表明，这些基因与细胞外基质-受体相互作用和局部黏附有关(Figure 1b-c)。这些结果表明，这些基因可能介导了口腔鳞癌中的TME。
YKT6基因被选为影响口腔鳞癌患者预后的HUB基因
大多数DEGs在口腔鳞癌患者的癌症标志物中上调。来自GSE13601的基因表达谱发现，与正常对照组织相比，口腔鳞癌样本中有946个DEG上调。在这项研究中，红色模块中连接性最高的100个基因与946个deg相交，产生29个候选基因(Figure 2a)。为验证29个候选基因对预后的影响，将GSE42743队列中的患者按29个基因表达高低分组，采用“Survminer”软件包获得的截断值，进行K-M生存分析和log-ranch检验。发现24个基因对患者的OS有统计学意义上的显著影响。在GSE41613和TCGA队列中执行上述筛选步骤后，作者使用来自训练集的相同截止值，最终得到可能影响OS和PFS结果的6个基因(YKT6、PLAU、BASP1、ANXA5、LGALS1和TGFBI） (Figure 2b）。在TCGA数据集中，SWSFS算法识别出一个组合了两个基因的模型(YKT6, PLAU; Figure 2c) 。有一个基因(YKT6)在大多数癌症中很少被报道，根据预后重要性排在榜首(Figure 2d)。在单因素Cox回归分析中，YKT6的表达具有统计学意义。此外，在使用GSE41613、GSE42743和TCGA数据的多变量Cox比例风险回归模型中，YKT6的表达被认为是一个独立的预后生物标志物( Figure 2e)YKT6已被证实在分泌途径的多个膜转运步骤中发挥重要作用，其功能障碍可能与肿瘤的恶性进展有关。值得注意的是，YKT6在癌症中的表达和功能，包括参与免疫相关的过程，在很大程度上仍不清楚。因此，YKT6被选为进一步研究的候选基因。根据当前研究中开发的诺模图计算分数来预测单个患者的1、3、5和7年的OS(Figure 2g)。校正曲线图表明，诺模图在根据理想模型预测患者OS方面表现良好(Figure 2h)。不出所料， nomogram模型预测OS的一致性指数在TCGA、GSE41613和GSE42743队列中分别为0.612、0.705和0.631。此外，AUC值显示，在所分析的因素中，YKT6的表达与肿瘤分期有关，对OS的预测效果最好(Figure 2i-k)。
YKT6在侵袭性HNSCC/OSCC中的表达升高
首先，探讨YKT6在HNSCC恶性中的作用。在MEXPRESS中，根据不同的临床因素(包括解剖肿瘤的分类、治疗后的疾病复发、EGFR状态、HPV状态、肿瘤组织学分级、新肿瘤的出现、是否有神经浸润和吸烟史)，YKT6呈现出不同的表达模式(Figure 3a)。卡方检验和Fisher‘s精确检验结果显示，YKT6的表达与亚型有关(Figure 3b）UALCAN检测结果表明，高病理分级、HPV阴性和TP53突变状态的患者YKT6mRNA表达增加Figure 3c-e)。YKT6在间叶型、非免疫型、免疫型3型和创面愈合亚型中的表达明显高于非典型型、主动免疫型、免疫型4型和干扰素-γ显性亚型，这反映了YKT6可能参与了转移和侵袭，并在免疫冷表型中富集（Figure 3f-i)。此外，基于包含167个肿瘤样品和45个正常样品的大规模OSCC数据集，YKT6在肿瘤组织中的表达高于正常组织（Figure 3j）在来自GSE78060的转移性LN组中也得到了类似的结果 （Figure 3k)。在GSE30784和GSE41613数据集中，通过估计分析，作者发现YKT6与肿瘤纯度呈正相关。与免疫评分呈负相关 （Figure 3l-m)。综上所述，这些结果表明YKT6过表达与HNSCC/OSCC的进展、复发、免疫功能障碍和不良预后有关。此外，对YKT6进行了基因组变异分析，发现YKT6存在深度缺失、浅层缺失、二倍体、拷贝数增加和扩增。值得注意的是，在TCGA-HNSCC组织中经常发现YKT6的拷贝数增加和扩增（Figure 3n)。YKT6基因拷贝数与mRNA表达水平呈显著正相关（Figure 3o）。YKT6的CNV在染色体上的位置如 Figure 3p所示。作者还发现肿瘤样本中YKT6的DNA甲基化水平降低 （Figure 3q)，并且YKT6mRNA的表达与cg44201263和cg44209692探针的甲基化水平呈弱负相关（Figure 3r)。WB和IHC染色蛋白水平结果与YKT6 mRNA水平的变化一致。WB显示YKT6在OSCC组织中的表达水平高于癌旁组织 (Figure 4a)。免疫组化染色显示，YKT6蛋白的表达随PN分期的升高而增加，在配对的癌旁组织中的表达低于口腔鳞癌组织。此外，有转移灶的LN组织中YKT6蛋白水平高于邻近无转移肿瘤的正常LN组织中的YKT6蛋白水平(Figure 4b-f)。肿瘤分级越高，预后越差，在两种组织芯片中，YKT6蛋白的表达随着口腔鳞癌的恶性进展而增加(通过组织学分级的变化来表示) (Figure 4g-i)。
YKT6被发现参与口腔鳞癌中与癌症相关的信号通路
利用GSE30784和GSE41613数据进行GSVA分析，探讨YKT6与生物学功能之间的关系。YKT6高剂量组细胞外基质、转化生长因子-β信号、缺氧、肿瘤信号转导途径、蛋白质分泌和输出、肿瘤坏死因子-α信号通过NF-κB显著增加。YKT6低表达组与T、B细胞受体信号通路显著相关 (Figure 4j-k)。这些发现与图1b-c所示的上述结果是一致的。基于这些发现，作者得出结论，YKT6在口腔鳞癌的恶性进展过程中起着重要作用。
YKT6在体外促进OSCC细胞的迁移和侵袭
伤口愈合实验表明，YKT6的敲低抑制了细胞迁移能力(Figure 5a-d)。Transwell分析，包括迁移和侵袭分析表明，当YKT6耗尽时，细胞的迁移能力和侵袭能力都降低了 (Figure 5e-j)。一些研究报道基质金属蛋白酶(MMPs)促进癌细胞在口腔鳞癌中的迁移和侵袭，包括MMP9。如 Figure 5k-m所示，随着YKT6基因敲除，口腔鳞癌细胞MMP9蛋白表达降低。通过上述生物信息学分析发现，YKT6的表达与转化生长因子-β信号通路密切相关，转化生长因子-β1被认为是口腔鳞癌迁移和侵袭的关键启动者。有趣的是，当YKT6被下调时，转化生长因子-β-1的分泌减少 (Figure 5n-p)。这些结果证实了YKT6可能在口腔鳞癌的体外迁移和侵袭过程中起重要作用。
YKT6高表达与低CD8+T细胞水平相关
在此基础上，作者探讨了YKT6与CD8+T细胞的关系。TIMER2检测结果显示，HNSCC中YKT6mRNA的高表达与CD8+T细胞水平呈显著负相关 (Figure 6a)。此外，YKT6 CNV的变化改变了CD8+T细胞的水平 (Figure 6b)。此外，作者还评估了YKT6mRNA表达/CNV与TCGA-HNSCC队列中其他五种免疫细胞浸润水平的关系。YKT6的表达与B细胞水平的关系值得关注。接下来，作者使用几种算法在口腔鳞癌中进行后续研究，在GSE30784和GSE41613数据集中，YKT6的表达与CD8+T细胞水平呈负相关(Figure 6c-e)。YKT6的高表达与B细胞和浆细胞水平低有关。除转录水平的结果外，免疫组化染色证实，随着YKT6蛋白表达的增加，CD8(代表肿瘤浸润的CD8+T细胞)的蛋白水平降低（Figure 6f-h）。由于趋化因子和趋化因子受体介导了TME中免疫细胞的运动，包括CD8+T细胞向肿瘤的募集。作者发现YKT6与HNSCC和OSCC中CCL5、CCR5、CCR2、CXCR3和CXCL9的表达呈高度负相关(Figure 6i-k)。总之，这些结果表明YKT6可能是肿瘤免疫微环境改变，特别是与CD8+T细胞相关的改变的一个潜在的生物标志物。
YKT6表达可预测ICB的临床疗效
为了进一步阐明YKT6在免疫治疗(以ICBS为代表)中的作用，作者将分析扩展到YKT6与几个众所周知的免疫检查点基因之间的关联。在TCGA-HNSCC队列中，YKT6的表达与PD-1、CTLA-4、IDO1、BTLA、LAG-3、TIM-3、TIGIT和Vista的表达呈负相关(Figure 6l)。在GSE30784和GSE41613中有很强的一致性(Figure 6m-n).接下来，作者分析了口腔鳞癌患者ICBS的临床疗效。据报道，当CD8+T细胞被激活时，以及在抗PD-L1和抗CTLA-4免疫疗法的应答过程中，细胞毒性、抗原呈递和扩大的免疫水平显著升高。作者发现，随着YKT6表达的增加，GSE30784和GSE41613队列中的CYT、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)比例、检查点水平、人类白细胞抗原(HLA)丰度、扩大免疫、抗原提呈细胞(APC)共刺激水平和T细胞共刺激水平均下降(Figure 7a)。潮汐评分与YKT6表达的增加显著相关(Figure 7b)。免疫治疗有效的患者口腔鳞癌组织中YKT6的表达低于免疫治疗无效的患者口腔鳞癌组织中YKT6的表达 (Figure 7c)。作者进一步研究了YKT6表达和IPS之间的关系，IPS是确定免疫原性决定因素和描述肿瘤内免疫状况的一个更好的预测因子。在GSE30784和GSE41613中，YKT6的表达与主要组织相容性复合体(MHC)评分、效应细胞(EC)评分和IPS评分呈负相关。关于抑制细胞(SC)评分，得到了相反的结果(Figure 7d-e)。此外，作者通过亚类图谱的方法研究了YKT6高表达和低表达的口腔鳞癌患者对特异性CTLA-4和PD-1免疫治疗的反应。有趣的是，YKT6低表达的患者对抗PD-1治疗有良好的反应，而YKT6高表达的患者对抗PD-1治疗无反应(Figure 7f-g)。以上分析提示，YKT6低表达患者可能比YKT6高表达患者对ICB治疗更敏感。为了进一步了解与患者预后相关的不同免疫因素，作者通过比较YKT6表达与TEDER和IPS评分的时间依赖性AUC值，确定YKT6表达预测OS的准确性。这两个队列中的这些分析表明，YKT6在预测口腔鳞癌患者生存方面比TEDE和IPS评分更好(Figure 7h-i)。在GSE35640和GSE91061数据集中，作者调查了YKT6是否可以预测患者对ICB治疗的反应。正如预期的那样，与YKT6表达较低的患者相比，YKT6表达较高的患者从免疫检查点治疗中获益的可能性较小(Figure 7j-k)，并测定了AUC值(>0.600)对预测客观反应的敏感性和特异性(Figure 7l-m)。
YKT6在人类癌症中的研究概况
考虑到YKT6相关肿瘤研究的缺乏，特别是在实体瘤中，作者评估了YKT6在31例非HNSCC实体瘤中的表达。总体而言，YKT6在许多癌症类型中过度表达。由于样本量的限制，YKT6在黑色素瘤和胶质母细胞瘤等一些癌症中没有发现差异表达(Figure 8a)。为了研究YKT6的表达与瘤内免疫状态的关系，作者分析了YKT6在6种免疫亚型中的表达。此外，在包括肝细胞癌在内的大多数肿瘤中，YKT6表达上调与低免疫评分、激活的CD8+T细胞水平、激活的B细胞水平、效应记忆CD8+T细胞水平、嗜酸性粒细胞水平、细胞色素T细胞、免疫信号评分、高肿瘤纯度、细胞外基质-受体相互作用水平、转化生长因子-β信号通路水平和EMT_2水平有关(Figure 8b-g）。同时，在包含9,163个肿瘤样本的独立TCGA肿瘤队列中，通过单因素Cox回归分析，也验证了YKT6表达对OS和PFS的预后价值。YKT6的表达在几个独立的TCGA队列中被支持作为一个预后生物标志物，其中一些包含高免疫原性、TMB和免疫浸润的肿瘤，如乳腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、尿路上皮癌和宫颈癌 Figure 8h)。最后，检测YKT6的表达在药物敏感性中的作用。多种化疗药物的IC50值与YKT6在多水平上显著相关。YKT6的表达可作为5-氟尿嘧啶和索拉非尼耐药的生物标志物。
本文小结：
作者的研究还揭示了YKT6与口腔鳞癌细胞体外迁移/侵袭和免疫微环境重塑密切相关，反映了YKT6在肿瘤发生和预后中的作用。然而，体内验证需要在我们未来的研究中解决。此外，应该在体外和体内系统阐明解释这些观察结果的更深入的分子机制，以优化治疗，其中可能包括将YKT6特异性抑制剂与口腔鳞癌患者的ICBS相结合的策略。
