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在急性髓系白血病中，克隆异质性对疾病行为或药物反应的影响尚不清楚。在2,829例患者的队列中，研究人员确定了与临床特征和药物敏感性相关的克隆性特征，7种突变(包括NRAS和TET2)的高变异等位基因频率与不良预后相关：
GATA2变异等位基因频率升高与更好的结果相关。
白细胞计数和母细胞百分比等临床特征与TP53和IDH1等亚克隆性突变丰度相关。
此外，在NPM1之前发生内聚蛋白突变的患者，或在剪接因子突变之前发生转录因子突变的患者，生存时间更短。
令人惊讶的是，克隆进化的分支模式与优越的临床结果相关。最后，一些突变(包括NRAS和IDH1)基于其亚克隆丰度预测药物敏感性。
总之，这些结果表明评估克隆异质性对预后的影响和可用于治疗的生物标志物的重要性。
急性髓系白血病(AML)是一种侵袭性癌症，由造血干细胞和祖细胞中体细胞驱动突变的积累和克隆扩展发展而来。虽然AML的突变负担相对较低，但患者存在异质性疾病，其特征是可变克隆和亚克隆基因型和相对稳定的细胞遗传学核型。这些特性使AML具有研究癌症克隆进化的几个有利特征。最近的研究已经注意到，白血病样本中的亚克隆在形态和免疫表型、对化疗或低甲基化药物的反应、对髓细胞生长因子反应的增殖以及在免疫抑制小鼠中植入等方面存在差异。新出现的报告也表明，增加的突变负担和克隆异质性与较差的生存结果相关。风险的增加是否与同一克隆中突变的连续积累或跨独立亚克隆的分布有关尚不清楚。也有越来越多的证据表明，克隆动力学影响AML的发展和临床结果。例如，通过变异等位基因频率(VAF)测量的特异性突变亚克隆发生率，已被证明除了预测复发时间外，还可以预测从不确定潜能克隆造血到髓系恶性肿瘤的进展。最近的研究还发现，ASXL1、DNMT3A、JAK2、TET2和TP53突变较高的VAF与AML中风险疾病患者较差的预后相关。此外，TP53 VAF和等位基因状态最近被证明是骨髓增生异常综合征(MDS)的预后因素。尽管VAFs在AML的这些和其他重点基因型中具有预后效用，但还没有一项综合分析使用VAFs来评估风险分层或识别治疗反应的差异。
新兴的单细胞DNA测序研究为白血病的进化和克隆结构提供了前所未有的分辨率，在很大程度上再现了在批量测序中观察到的趋势。由于队列规模，这些研究不足以将颗粒性克隆特征与临床结果联系起来。相比之下，AML的几项大规模测序研究提供了广泛的克隆趋势、组合遗传特征与临床结果的相关性以及靶向治疗应答的生物标志物。然而，在这些队列中，克隆进化和VAF尚未与治疗反应或更细颗粒的风险分层系统集成。为了解决这些问题，研究人员聚集了临床注释型AML患者队列，并分析了复发性体细胞突变的克隆结构，以确定与疾病表现特征、生存结果和药物敏感性的潜在相关性。在这里，研究人员展示了未报道的与突变共现模式、VAF和克隆进化轨迹相关的生存关系，这些关系是传统分析(突变存在/缺失)无法观察到的。研究人员还根据特定突变的克隆丰度推断出独特的药物敏感性，从而为某些突变如何通过亚克隆丰度影响体白血病提供了见解。研究人员的发现验证了将克隆分析纳入AML分子评价和治疗的临床重要性。
共有13项研究被聚集到一个包含2829例患者样本的数据库中，该数据库使用了DNA测序方法和体外药物筛选的混合方法(图1a和补充图1a)。该队列包含了临床特征和治疗历史的总结(补充图1b, j)。研究聚集概括了先前报道的AML突变频率，在共发、互斥和预后的突变模式方面有广泛的相似性(图1b)。值得注意的是，研究人员增加的队列规模发现FLT3-TKD和RAD21是以前未报道的与良好结果相关的突变(补充图1k)。对于报道VAFs的研究，双峰分布突出了克隆和亚克隆群体的存在(补充图1l)。单个基因的VAF分布在平均VAF中也显示出显著的变异性，这反映了突变之间克隆和亚克隆动态的不同模式(补充图1m)。总共有2038例新发VAF患者和生存结果数据被确定用于后续分析。
AML是一种低突变负荷的癌症，因此为研究突变如何相互作用促进和推动疾病进展提供了理想的模型疾病。在癌症发展过程中可以选择特定的突变组合，并驱动克隆扩张，因为它们的共存提高了肿瘤的适应度，从而驱动了癌症测序研究中观察到的上位性模式。从理论上讲，如果上位性是由白血病适应度的选择压力驱动的，那么在广泛的二元上位性趋势和疾病表现特征和患者结局之间可能存在相关性。为了更好地理解共发突变之间的关系如何影响疾病的各个方面，研究人员首先定义了个体突变与临床表现特征之间的关联(补充图2)。研究人员发现了多种关联，例如发现IDH2，而不是IDH1，与低乳酸脱氢酶(LDH)水平相关的突变(补充图2)。
接下来，研究人员使用扩增队列规模来定义频繁突变的统计共现和互斥性(图2a)。除了之前报道的关联之外，研究人员还发现了几个未报道的共现现象(例如EZH2和CBL)或互斥模式(如TP53和KRAS)(补充图3a)。接下来，研究人员分析了两两突变与生存之间的相关性(图2b)。研究人员发现了多个在单一突变水平上同时发生突变重新分层(如NRAS + SRSF2)或加强生存相关性趋势(如NRAS + RAD21)的病例。有趣的是，以生存关联覆盖上位性景观显示成对上位性(优势比)和生存(危险比)之间没有相关性(图2c)。更具体地说，在增加的共现比值比的基础上，更糟糕的结果没有得到充实，这表明突变共发生频率的增加不一定会促进白血病适应度的提高。一种可能的解释是，同一白血病中同时发生的突变可能不会发生在同一细胞中，而是占据不同的克隆/亚克隆群体。例如，当研究人员研究共发NRAS和KRAS突变之间的关系时，研究人员观察到一种强烈的反向克隆模式(一个基因的高VAF与另一个基因的低VAF相关)，表明这些突变发生在独立的细胞群体中(补充图3c)。研究人员观察到NRAS和PTPN11突变之间有类似的模式(补充图3d)。鉴于它们在RAS/MAPK信号通路中的功能冗余，这些结果表明在AML中RAS/MAPK信号通路过度激活的克隆中具有互斥性。事实上，最近髓系恶性肿瘤的单细胞基因分型提供了明确的证据，RAS/RTK基因突变往往是相互排斥的。
接下来，研究人员测试了共同发生的突变可能导致疾病表现差异的假设。成对突变分析显示，几种基因型与骨髓和外周血中白细胞(wbc)、血小板、LDH和母细胞百分比的丰度之间存在很强的相关性(补充图3e)。值得注意的是，FLT3、IDH2、TP53、CEBPA和NRAS的突变效应大小因其共同发生的突变而显著不同(对照补充图3e和2)，表明克隆基因型和疾病表现特征之间存在复杂的相互作用。
研究人员还研究了同一基因或功能类别/通路中的多个突变是否与临床特征或风险相关。与只有一个突变的患者相比，CEBPA的多个突变预示着高血小板计数、低血红蛋白计数和外周血爆裂率、年龄增大、和更好的生存结果(补充图3f g)。多重命中TP53与更高的骨髓和外周血细胞百分比和年龄降低相关，而FLT3-TKD的多重突变与年龄增大相关(补充图3f)。转录相关基因的多个突变与白细胞计数、血红蛋白水平和外周血母细胞百分比降低相关，同时也与血小板计数增加和改善结果相关(补充图3h, i)。肿瘤抑制因子中不止一个突变预测更高的骨髓母细胞百分比，而RTK/RAS信号成分的多个突变与改善的结果相关(补充图3h, i)。最后，与染色质重塑和内聚蛋白成分相关的基因的多个突变与较低的WBC计数、更年轻和更坏的生存结果相关(补充图3h, i)。
接下来，研究人员进一步分析了三突变基因型与两两突变基因型之间的预后相关性。总的来说，48种不同的三突变基因型至少有10例患者同时存在三种突变(图2d)。研究人员证实了DNMT3A、NPM1和FLT3-ITD突变患者的不良预后(q <0.01;HR = 1.77;95% CI: 1.37 2.29)，除此之外，DNMT3A、NPM1和NRAS突变患者的预后也得到改善(q = 0.01;HR = 0.48;95% ci: 0.31 0.76;图2 e) 8。重要的是，研究人员的分析揭示了未报道的四种基因型的生存相关性:DNMT3A:FLT3-ITD:IDH1, DNMT3A:FLT3-ITD:IDH2, DNMT3A:FLT3-ITD:PTPN11与更坏的预后相关，而NPM1:DNMT3A:RAD21预测更好的预后(图2 e)。值得注意的是，与生存相关的基因型仅对更频繁发生的患者基因型略有富集(图2d)，这表明上位性模式是白血病侵袭性增加的一个微弱预测因子。
因为较差的生存率与更频繁的两两和三次突变的基因型无关，研究人员想知道是否其他方面的突变克隆可能有助于阐明临床表现和结果的特征。这些观察促使研究人员对AML的克隆景观进行建模，以了解更多的颗粒性克隆方面(例如VAF或突变排序)，而不是简单的突变存在或不存在，是否可能与疾病的特征相关。
为了研究突变克隆性与疾病表现和生存之间的关系，研究人员首先根据频繁突变的中位拷贝数校正VAF定义了每个突变的高VAF和低VAF阈值(图3a和补充图4a)。研究人员观察到，许多基因型基于中位VAF的分层与白细胞计数、LDH水平和外周血中母细胞的丰度密切相关(图3b)。有趣的是，SF3B1的高VAF(而不是其他剪接体基因)与白细胞计数增加有关(图3b)，表明不同剪接体成分的突变可能存在表型差异。有趣的是，当考虑突变的分类存在或不存在时，许多使用VAFs识别的突变表型关联并不明显。研究人员注意到，当比较二元和VAF相关性与临床特征时，效应大小的方向性存在显著差异(图3c)。例如，TP53突变的存在与低WBC和PB的blast百分比相关，而高TP53 VAF与增加WBC和PB的blast百分比相关(图3 c)。相比之下，IDH1和NPM1突变中VAF的存在和较高的VAF分别与PB爆炸百分比和WBC计数的增加相关(图3 c)。总之，这些结果表明，突变的VAF对与疾病表现的临床特征相关的突变的效应大小具有累加的、中性的或再分层的影响，这可能反映了克隆组成对疾病行为的影响。
研究人员进一步研究突变VAF在风险分层中的相关性。使用先前报道的30%的阈值来定义高VAF22，研究人员对从头AML患者中最常见的突变进行了生存分析。单变量Cox比例风险回归模型确定了4个基因(BCOR、KRAS、U2AF1和NRAS)，这些基因在高VAF (q <0.3;补充图4 b)。因为应用于所有基因型的启发式阈值可能会错过显著的基因特异性相关性(补充图4b, c)，接下来，研究人员使用最大选择的秩统计量为每个突变确定最佳阈值(补充图4d, e)。研究人员发现VAF阈值可以显著地重新分层8个突变的结果(图3 d)。对于大多数突变(NF1、BCOR、PHF6、ASXL1、KRAS、PTPN11和NRAS)， VAF增加与较差的预后相关(图3d, e和补充图4e)。然而，对于GATA2，较高的VAF与较好的预后相关(图3d, e和补充图4e)。这些分析提供了证据，表明VAF为了解AML中疾病表现和风险分层的临床特征提供了额外的信息。这些结果促使研究人员研究突变之间的克隆关系如何可能与结果相关。
实验和计算方法揭示了白血病发生过程中突变功能类别排序的强大趋势，初始突变发生在调节表观基因组的基因中，随后发生在参与调节增殖的基因中。由于这些趋势，研究人员假设非典型的突变获取顺序可能与白血病表型差异相关。事实上，最近在骨髓增生性肿瘤(MPN)和MDS中的证据支持这样一种观点，即突变获得的顺序可以对疾病发展和患者生存的分层产生显著影响。为了在AML中验证这一假设，研究人员利用队列规模，通过比较VAF关系来推断共发突变对的突变获取顺序(图4a)。对于有足够多患者具有明确顺序的成对基因型(n = 27)，研究人员根据假定的突变获得顺序进行生存分析。研究人员观察到，共发NRAS和GATA2突变的顺序对患者的预后有很强的分层;与之后发生NRAS的患者相比，在GATA2之前发生NRAS的患者生存率明显较低(图4b, c)。考虑到他们的两两VAF关系(图4c)，这一结果与研究人员之前的观察结果一致，即NRAS中的高VAF与较差的结果相关，但高GATA2 VAF与改善的预后相关(图3 d)。
接下来，为了增加可供生存分析的患者数量，研究人员将突变分组为功能类别。使用Bradley Terry模型，研究人员根据突变获得的相对顺序对其进行排序，并观察到与之前报道相似的趋势:表观遗传失调通常发生在早期，而促进增殖的突变发生在肿瘤发展的晚期(图4d)。然后，研究人员在类别明确排序的患者组之间进行生存分析(n = 12)，并确定了两例功能类别突变排序显著分层生存(图4e)。在NPM1和染色质/内聚蛋白复合物同时发生突变的患者中观察到最强的相关性(图4e)。在这些患者中，如果染色质/内聚蛋白突变发生在NPM1突变之前，则与较差的生存率有很强的相关性(图4e, f).同样，当转录因子突变发生在剪接突变之前时，患者的预后较差(图4e, g).这些结果在人类数据中提供了证据，表明突变的排序在AML中具有预后意义。
最近的报道表明，克隆异质性(即突变/克隆负荷和Shannon多样性指数)是AML8的预后指标。为了在研究人员的队列中调查类似的特征，研究人员分析了全外显子组测序的样本(n = 731)来模拟AML的克隆结构(图5a)。使用PyClone(一种单细胞验证的统计推断方法，用于模拟克隆群体结构)，研究人员对队列中的每个样本确定了不同的克隆基因型和癌细胞组分(图5b和补充图7a,b)。研究人员证实，较高的突变负担与较差的生存率相关(补充图7 c);然而，与之前的报告相比，研究人员发现克隆负荷和结果之间没有相关性(补充图7 d)。研究人员还观察到突变或克隆负荷与年龄或欧洲白血病(ELN)风险之间没有统计学相关性(补充图7e,h)。意料之中的是，突变负担和唯一克隆数量之间存在很强的相关性(图5 c)。因为突变和克隆负荷之间有很强的相关性，但只有突变负荷与生存相关(补充图7c, d)，研究人员试图了解突变在克隆中的分布是否与结果相关。的确，每个克隆较高的中位突变负担与不良预后相关(图5d)，表明在同一克隆群体中突变的积累与白血病适应度的增加相关。
为了进一步表征这些白血病的结构，研究人员使用ClonEvol模拟克隆进化轨迹(图5a和补充图7i)。研究人员观察到大多数肿瘤显示线性轨迹而不是分支进化(补充图7j)，这与最近的一份报告一致。AML患者表现出分支进化，与线性进化肿瘤相比，突变和克隆负担增加(补充图7k, l).引人注目的是，尽管有增加的突变负担，表现出分支克隆进化结构的患者显示出明显更好的总生存率(图5e、f和补充图7k)。有趣的是，克隆多样性，通过多个指标衡量，与结果无关;然而，研究人员观察到，高突变负荷重新确定了出现分支进化的患者的结局，而这种关联在出现线性进化的患者中未见(图5g和补充图7o, p)。分支肿瘤的低突变(但非克隆)负荷鉴定了一个低风险患者亚群;这些结果揭示了克隆异质性和白血病适应度之间的独特相互作用(图5h)，并定义了患者的低风险子集。
以前的工作是建立突变特异性药物敏感性模型，使用的是突变是否存在，而不是它们的克隆丰度，来关联基因组改变与药物反应。为了研究突变的克隆性是否与药物敏感性相关，研究人员分析了原发性AML样本的离体药物筛选数据，并建模了VAF和药物反应之间的相关性(图6a)。通过对野生型和突变型样品的差异药物敏感性分析，除了nras依赖的耐药外，还确定了FLT3状态与酪氨酸激酶抑制剂(TKI)应答之间的预期相关性(图6b)。分析重复突变的复制数校正VAF图谱显示克隆丰度的显著变异(图6c和补充图8a)，表明基于特异性突变亚克隆流行率的潜在药物敏感性范围。对于VAF和药物反应具有足够异质性的药物基因对(见方法)，对VAF药物敏感性的线性回归识别出多个VAF与靶向药物敏感性强烈相关的病例(图6d和补充图8b,d)。研究人员注意到大多数预测基因的独特趋势;较高VAF的IDH1和NPM1只显示对药物的敏感性增加，而较高的NRAS VAF只显示对多种药物的耐药性增加(图6d)。VAF与药物敏感性之间最强的相关性之一是ponatinib和IDH1之间的相关性，其中VAF增加35%与127的AUC下降相关(图6 e)。相反，VAF与耐药之间最强的相关性之一是pelitinib与NRAS之间的相关性，其中VAF增加42%与AUC增加176相关(图6 f)。特别有趣的是，在flt3特异性或一般TKIs组中，FLT3-TKD VAF比FLT3-ITD表现出更显著的AUC-VAF相关性(图6d和补充图8d)。由于基于FLT3状态的患者生存高度依赖于其他突变的存在，研究人员在共同突变背景下重新分析了FLT3 vaf依赖的敏感性。FLT3-ITD与DNMT3A的同时出现预测了对axinatinib、cediranib、crizotinib、ponatinib和tofacitinib的耐药，并以ITD vaf依赖的方式发生(图6g)。这些结果表明，AML中继发突变的亚克隆发生率可能预测靶向治疗的反应。
当研究人员在从头队列中比较通过二元分析和VAF分析确定的药物基因相关性时，研究人员发现药物基因对没有重叠(补充图8e)，表明使用VAFs建模药物敏感性识别AML突变和靶向药物之间的独特关联。特定的临床意义,研究人员观察到,国家管制当局方面VAF是耐药的重要因素在新创和二级AML样本,尽管次级样本天生更对同一组比新创samples靶向制剂。鉴于NRAS是AML中第四大最常见的突变，这些结果表明，这是一种以前未被重视的生物标志物，可用于检测当前和新兴的靶向治疗的耐药性。总之，这些结果确定了多种药物基因的敏感性关系，这为进一步的实验验证和AML临床试验中治疗反应的回顾性分析提供了依据。
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在此，研究人员报告了一个通过深度测序的AML大的聚集队列，并描述了风险分层和对一系列小分子抑制剂敏感性预测的几个独特特征。特别有趣的是，研究人员观察到未报道的VAF和白血病克隆进化结构与药物反应和临床结果之间的联系。这些观察结果表明，基因相似的患者在疾病风险和临床反应方面可能存在一个未被重视的细微差别。研究结果表明，VAF是改善特异性AML基因型风险分层的临床有用特征。这一观察结果可能反映了治疗干预时间点的差异，而不是疾病的潜在生物学。例如，研究人员观察到NRAS VAF低的患者比NRAS VAF高的患者预后更好，这可能反映了低VAF患者在疾病进展的早期被诊断和治疗。然而，研究人员观察到NRAS VAF是耐药的一个强有力的预测因子，这支持了特定亚克隆基因型的生物学特性可能驱动VAF风险分层的假设。然而，仅某些突变的VAF增强风险分层的潜在生物学原因仍有待了解。研究人员观察到，特定突变和功能类别的排序具有预后意义，这可能反映了初始突变类型在白血病侵袭性方面的潜在差异。
