大家好！今天给大家分享的文献是2022年1月发表在Cancer Cell（IF=31.74）上的文章。前期基因组和转录组测序已揭示肝内胆管癌的遗传图谱，多组学的发展，包括蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学结合基因组学，阐明了新的疾病亚型和信号通路，并发现了癌症治疗的潜在靶点，这种多组学策略可能有助于揭示新的机制和确定新的靶点，为肝内胆管癌患者提供额外的治疗选择。这篇文章就是蛋白质基因组学水平上确定了肝内胆管癌的新亚型。

Proteogenomic characterization identifies clinically relevant subgroups of intrahepatic cholangiocarcinoma

蛋白基因组学的特征确定了肝内胆管癌的临床相关亚群

文章思路：

摘要图片

摘要：作者利用262例患者配对的肿瘤和邻近肝组织对肝内胆管癌（iCCA）进行了蛋白基因组学测定。整合的蛋白基因组学分析优先分析了遗传变异并揭示了iCCA发病机制。黄曲霉毒素特征与肿瘤发生、增殖和免疫抑制有关。突变相关信号特征显示TP53和KRAS共突变可能通过整合素-FAK-SRC通路促进iCCA转移。FGFR2融合激活Rho GTPase通路并可能是新生抗原的潜在来源。蛋白基因组学分析识别出4个亚群（S1-S4），并具有特异性的生物标志物。这些亚群在预后、基因变异、微环境失调、肿瘤微生物组成和潜在治疗方面具有显著特征。SLC16A3和HKDC1被进一步鉴定为与iCCA细胞代谢重编程相关的潜在预后生物标志物。本研究为进一步确定iCCA的分子发病机制和治疗机会提供了宝贵资源。

结果：

1.中国人群iCCA的蛋白基因组学图谱

作者对262例iCCA患者的遗传谱和相关临床病理特征进行了分析（图1A）。最终确定了复旦大学人群（FU-iCCA）、MSKCC和ICGC中8个显著突变的基因突变频率（图1B）。FU-iCCA人群与其他已发表的iCCA人群之间的突变特征进行比较时发现黄曲霉毒素特征在7.1% FU-iCCA人群和9.7%的Zou等人的研究中存在，这两组研究对象均为中国人群，但在三个西方人群中均不存在。马兜铃酸（AA）也有这种类似的趋势（图1C）。比较有明显黄曲霉毒素特征、马兜铃酸特征和其他特征的iCCA人群肿瘤TMB和肿瘤新抗原时发现黄曲霉毒素和AA特征的样本TMB和新抗原载量显著升高（图1D）。通过比较所有具有或不具有黄曲霉毒素特征的肿瘤的多组学数据，发现具有黄曲霉毒素特征的肿瘤表现出DNA修复和细胞周期通路上调，凋亡、感染炎症和免疫通路下调（图1E）。进一步分析发现，TP53突变，尤其是R249S突变与黄曲霉毒素特征显著相关（图1F和1G）。

图1 FU-iCCA人群基因组图谱

2.体细胞拷贝数变异的多组学分析

拷贝数变异（CNAs）对mRNA、蛋白质和磷酸化蛋白丰度有顺式和反式的影响（图2A）。mRNA、蛋白质和磷酸化蛋白分别观察到3981、1081和408个显著的顺式相关性，在3个组学中只有194个显著的顺式效应（图2B）。总共有963个蛋白质同时显示了CNA-mRNA和CNA-蛋白顺式效应，这些效应主要富集在代谢、生物合成和蛋白质加工途径中（图2C）。在前10个反式效应的癌症基因普查（cancer gene census, CGC）中MDM4扩增与免疫治疗超进展有关（图2D）。在染色体1p和14q中，显示出最多反式效应的基因为CNA-蛋白质和CNA-mRNA（图2A）。值得注意的是，14q缺失显示出与全蛋白质组和转录组丰度的差异相关（图2E），提示这些区域可能存在蛋白质水平的调控。对于蛋白质丰度随14q缺失增加的585个基因，富集分析揭示了它们与剪接体、错配修复、DNA复制、细胞周期和代谢有关（图2F）。此外，14q缺失对蛋白质表达有顺式和反式的影响，而不是mRNA表达（图2G）。总之，14q相关的顺式和反式的缺失可能为iCCA的肿瘤发生提供机制基础（图2H）。

图2 拷贝数变异对mRNA和蛋白质丰度的影响

3.体细胞驱动基因突变的蛋白质基因组关联性分析

TP53突变与细胞周期、药物代谢、吞噬体和碳代谢通路上调有关，也与ECM黏着斑、PI3K-AKT和Hippo-YAP信号通路下调有关（图3A）。KRAS突变与炎症-感染和ECM黏着斑信号通路中的蛋白增加有关，与细胞周期中的蛋白减少有关（图3B）。有趣的是，作者选用的人群中10/215名iCCA患者存在TP53和KRAS共突变，且生存率明显低于TP53或KRAS单突变患者（图3C），这表明它们有独特的分子特征。细胞黏附相关分子ITGA6、ITGB4、ITGB6、CDH3和CLDN18在TP53^Mut和KRAS^mut肿瘤中表达量最高（图3D和3E）。TP53^Mut和KRAS^mut肿瘤区域淋巴结转移率最高（40%），因此TP53、KRAS共突变可能通过整合素-FAK-SRC通路促进iCCA转移和疾病进展（图3F）。进一步分析表明，在BAP1^Mut和IDH1/2^Mut肿瘤中，ECM和胆汁分泌通路是相互激活的，而吞噬体、炎症和MAPK通路仅在其中一种突变类型的肿瘤中被激活（图3G和3H）。mRNA和蛋白水平上分析显示热点靶药基因在TP53、KRAS、BAP1和IDH1/2突变群中明显富集（图3I）。

图3 驱动基因突变对蛋白基因组图谱的影响

4.与FGFR2变异和KRAS突变相关的磷酸化蛋白组学畸变

iCCA中FGFR2信号增强是由突变和染色体易位介导的。作者表明，所有FGFR2突变都位于激酶结构域外（图4A）。融合基因的FGFR2断裂点(p.E767)相同，并保留其激酶结构域（图4B）。每种融合都通过荧光原位杂交进行了验证（图4C）。因为FGFR2突变和KRAS突变可能会影响MAPK、PI3K-AKT-mTOR和Rho GTPase通路，作者探索了有和没有这些变异的肿瘤中显著改变的磷酸化位点及其相应的蛋白表达，揭示了两者磷酸位点的异常值（图4D）。KRAS突变肿瘤表现出明显的MAPK通路级联激活，如MAPK14在T180和Y182上均磷酸化，MAP3K2在S514磷酸化，RPS6KA4在S343和T687磷酸化。相反，在FGFR2变异的肿瘤中，MAPK通路轻微下调，而Rho GTPase通路显著上调（图4E）。此外，FGFR2变异的肿瘤表现出显著的PTPN11（Y62）和TLN1（Y70）酪氨酸磷酸化，在蛋白水平上观察到相似趋势（图4F）。热图显示FGFR2和PTPN11蛋白以及PTPN11 Y62磷酸化水平上调，伴随着FGFR2变异的肿瘤中GRB2表达下调和S90磷酸化。值得注意的是，异常残基Y62位于N-SH2和PTP结构域之间，此时磷酸化被认为可以稳定活性蛋白的构象（图4G和4H）。

图4 FGFR2突变和KRAS突变对蛋白质基因组学图谱的影响

5.对来自FGFR2::BICC1融合的新表位和相应T细胞应答进行鉴定

对于两个最常见的FGFR2::BICC1融合蛋白，利用跨越断点残基的序列建立了包含所有可能的8-10个氨基酸多肽的序列数据库（图5A）。通过四聚体交换实验，一组肽被成功地交换成HLA-A02:01和HLA-A24:02四聚体（图5B），然后ELISPOT验证，CyTOF数据表明T细胞表型随着多肽刺激发生进化（图5C）。伪时间分析显示，T细胞逐渐活化，随后分叉进入记忆和耗尽2个分支，在成熟后期表现为两种谱系；同时表达CD45RA（T_EMRA）的效应记忆T细胞亚群增加，尤其是效应T细胞（Teff）和pE2，而naive T细胞和中央记忆T细胞减少（图5D）。因此，受多肽刺激的T细胞有效应表型CD8⁺ T细胞显著扩增特征。进一步TCR-seq显示，在肽刺激后，供体2的TCR发生了显著转变。并对TCR克隆型的分布和TCR谱的相似性进行分析（图5E）。作者证实多肽32刺激供体2后TCR发生重排，并扩增了多个频率相对低的CDR3s（图5F）。尽管供体间存在异质性，但低频率的新表位T细胞反应为iCCA融合患者克服免疫编辑和耐药性提供了有价值线索。

图5 鉴定来自FGFR2:BICC1融合的潜在新表位及其对应的T细胞表型

6.具有明显生物学和临床特征的蛋白质亚群

用具有多种临床、基因组、免疫学和微环境特征的1376个蛋白进行聚类分析，作者发现4个不同的蛋白质亚群（S1-S4）（图6A）。S1中CD14、MPO、C5AR1等炎症蛋白表达最丰富。S2与癌症相关的成纤维细胞和ECM相关蛋白水平最高，包括FAP、POSTN和FLT1。S3是MAPK和代谢相关蛋白升高。S4粘附蛋白和胆道特异性蛋白表达最高（图6B）。临床上S1多为CA19-9水平升高、肿瘤坏死、肝内转移的肿瘤。S2有较高的淋巴结转移。S3以HBV感染患者为主。S4主要富集于CA19-9水平较低、转移较少的患者。4个蛋白质亚群总生存期差异明显（图6C）。每个亚群都有不同的周期性变化的基因（图6D），并对每个亚群中免疫检查点、免疫标志物和免疫细胞丰度进行了分析（图6E）。四个亚群的特异性标志物MPO、POSTN、ALDOB和EPCAM分别代表炎症（S1）、间充质（S2）、代谢（S3）和分化（S4）（图6F）。在FU-iCCA人群和验证人群中，通过多重免疫染色检测的4个标记物的表达可以对患者生存情况进行分层分析（图6G）。

图6 FU-iCCA人群中蛋白质组学分层及相应的分子和通路特征

7.蛋白质组学预后生物标志物的鉴定和验证

作者进行监督分析来确定预后生物标志物，通过严格筛选发现19个预后良好蛋白和15个预后不良的蛋白（图7A）。其中，HKDC1和SLC16A3分别是FU-iCCA人群中与患者生存呈正相关或负相关的显著因子（图7B）。HKDC1和SLC16A3在4个蛋白质亚群中表达差异显著，S1中SLC16A3表达上调，S4中HKDC1表达上调（图7C）。通过免疫染色检测HKDC1低表达和SLC16A3高表达分别与预后差有关（图7D）。与先前报道不同，HKDC1过表达降低了HuCCT1细胞的增殖、集落形成、葡萄糖消耗和糖酵解能力，支持其在iCCA细胞中的抗糖酵解/增殖作用（图7E和7G）。正如预期，过表达SLC16A3的HuCCT1细胞表现出增殖快和集落形成能力强（图7F），这可能是由于更强的糖酵解能力（图7H）。

图7 蛋白质组学预后生物标志物的鉴定和验证

结论：

本研究报道了262个iCCAs大规模蛋白质基因组特征，包括WES、RNA-seq、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。根据WES数据，黄曲霉毒素特征被确定为主要的突变模式，通过损害基因组稳定性、加速细胞周期和抑制免疫炎症反应，这可能有助于iCCA的病理发生。iCCA中TP53和KRAS共突变预后极差，转移增加，可能通过整合素-FAK/SRC通路起作用。FGFR2融合和突变可能通过激活Rho GTPase通路而不是传统的MAPK通路来促进iCCA。这些发现可能为靶向这些特定的基因改变打开新的治疗机会。此外，来自FGFR2:BICC1融合的免疫原性多肽作为早期克隆发生，可能作为免疫原性靶点。发现了四个亚群，为微环境改变提供更好的分层，这可能有助于亚群特异性免疫治疗和靶向治疗。HKDC1和SLC16A3是具有生物学功能的重要预后指标，尽管这两个生物标志物都是糖酵解代谢的组成部分，但它们代表了两种相反的预后方向，并可能指导iCCA患者不同的治疗方法。

总之，综合基因组、转录组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组和微生物组数据，确定了基因组和转录组分析未完全捕获的潜在分子机制和疾病亚群，这些信息可能会为个性化靶向治疗和免疫治疗的发展开辟新的途径，最终使临床实践受益。希望本文所描述的结果和分析及相关数据，将为深入研究iCCA的癌变、进展和治疗提供丰富的资源。

参考文献：Dong L, Lu D, Chen R, et al. Proteogenomic characterization identifies clinically relevant subgroups of intrahepatic cholangiocarcinoma[J]. Cancer Cell. 2022,40(1):70-87.e15.