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空间结构的分析离不开相应的平台，这篇文章使用的测序技术有Hi-C，ChIP-seq，ATAC-seq，CUT&Tag，Factory RNA-seq（新生RNA水平），这将RNAPII在基因表达中的作用与染色质结构中的作用协调展示。这篇文章发表在期刊期刊: Science Advances，在最近一年的影响因子为14.136比上一年增加了1.02。
背景知识：
哺乳动物染色体是三维实体。染色体构象捕获(3C)技术的发展和扩展深刻地更新了我们对真核染色体的空间组织及其功能和维持的理解。除了粘附素，另一个以转移DNA而闻名的分子马达是RNA聚合酶(RNAP)。然而，它对染色质折叠的贡献仍然存在争议。不同的证据表明，RNAPII与染色质的结合和空间相互作用的不同形成之间存在联系。
TAD: topologically associated domain拓扑关联域
结果解读：
RNAPII是细胞存活所必需的，因此它的耗尽可能只是短暂的。因此，作者开发了一个人类DLD-1结直肠癌细胞系，其中最大的RNAPII亚单位RPB1的N端标记有一个微小AID(MAID)结构域。作者用DOX/生长素处理2小时可使RNAPII蛋白水平降低60%以上，而用Western blotting评估，14小时的处理可使RNAPII蛋白水平降低80%以上，而不影响RNAPI或RNAPIII水平(Fig. 1A)。为了进一步描述细胞系，作者使用针对RPB1中mClover标签的抗体进行染色质免疫沉淀测序(CHIP-SEQ)。聚合酶降解伴随着转录起始点(TSSs)染色质的显著降低(Fig. 1B)，这与最近用小鼠胚胎干细胞(MESCs)发现的相似。作者还查询了H3K27ac(标记活性染色质)和H3K27me3组蛋白修饰(标记兼性异染色质)。当RNAPII耗尽时，观察到显著的H3K27ac降低伴随着H3K27me3水平的升高。接下来，作者探索在RNAPII耗尽时，间期染色质的空间组织是否也发生了变化。作者将原位Hi-C应用于G1期分选的DLD-1-RPB1-MAID细胞、用生长素处理的细胞、不用生长素处理的14小时细胞和雷公藤甲素处理的细胞。G1细胞的使用消除了S/G2期细胞产生的异质性，以生成更详细的Hi-C图。经过数据分析，图像只显示出A-/B-compartments的边际差异(Fig. 1, C and D)。在对照的4110个细胞中，小于20%的Hi-C数据在RNAPII缺乏的细胞中发生变化，TADS也只显示了轻微的干扰(Fig. 1, E and F)。在生长素/雷公藤甲素处理的细胞中可以检测到227个新的TADs，并在它们的边界显示出强化的绝缘现象(Fig. 1F)。TADS内/周围的交互信息文件显示，以TAD内部交互为代价，对其边界的定义更强(Fig. 1G)。到目前为止，作者的数据与最近在mESCs中观察到的结果相吻合。然而，作者也在生长素处理的细胞中检测到>1500个loop。这些细胞明显大于对照细胞或在不同条件下共享的细胞(Fig. 1, H and I)。其中，生长素和生长素/雷公藤甲素处理的细胞共有的805个loop也更大，并在锚定处表现出更高的绝缘性(Fig. 1, H到J)。为了理解这些更强的loop的出现，作者计算了它们形成的环域内累积的新生RNA表达水平。与来自控制单元的所有loop或共享loop相比，这805个loop明显更多地与顶部loop结构域相关联。总而言之，作者的数据揭示了间期急性RNAPII耗竭时TAD和loop组织水平上的微妙但可辨别的影响。
由于RNAPII缺失对异步化细胞群体中的间期染色质组织没有明显影响，作者推测RNAPII缺失可能与有丝分裂后染色质折叠的重建有关。这是基于两个观察结果：第一，对有丝分裂到G1转变过程中染色质折叠动力学的描述：在有丝分裂到G1转变中，顺式元件之间的接触形成早而快，通常与CTCF/粘附素无关；第二，在转变的早期，所有活性增强子和基因中，超过50%的基因表现出强烈的转录尖峰。为了研究有丝分裂退出后染色质的重折叠，作者使用CDK1抑制剂RO3306（阻断约90% G2细胞）在G2-M检查点同步了MAID-RPB1细胞(Fig. 2, A和B)。然后通过有丝分裂将它们释放到G1期。清除抑制剂6小时后，>70%的细胞重新进入G1期，并通过荧光激活细胞分选(FACS)收集(Fig. 2, A和B)。RNAPII的降解通过分级、全细胞印迹、Ser5磷酸化的RNAP的免疫荧光和新生RNA的5-乙炔基-UTP(EUTP)标记得到证实(Fig. 2C)。染色质中丰富的SWI/SNF染色质重构体亚基的水平发生了变化，但CTCF的介入基本保持不变(Fig. 2C)。接下来，作者对经生长素处理或不经生长素处理的G1-REENTRY细胞进行了Hi-C实验。结合3D-DNA FISH证实RNAPII降解引起染色体间互作增强而染色体内互作减弱，compartment边界明显模糊(Fig. 2D)，A-和B-compartment节段之间>1 Mbp(百万个基本配对)距离处的相互作用变得更强(Fig. 2E)。作者观察强烈且广泛的domain结构、局部insulation和loop形成的缺失(Fig. 2, F和G)。在对照细胞中发现的所有4500个TAD中，insulation都减弱了。在没有RNAPII的情况下，没有重建的10%的TAD边界中的insulation甚至更弱(Fig. 2H)。RNAP耗尽的REENTRY细胞也比对照细胞有更少和更大的TADS (Fig. 2I)，表明边界坍塌和TAD合并。这些效应与RNAPII和活性组蛋白标记在TAD边界的富集是一致的(Fig. 2J)。在loop水平上，RNAPII耗尽的细胞基本上丢失了1900个，同时出现了超过1150个新的和明显更长的loop(Fig. 2K)。在对照和生长素处理的reentry细胞中检测到的2443个loop在没有RNAPII的情况下被削弱，同时在它们的锚定处也显示出减少的insulation (Fig. 2, K - M)。作者再一次比较了无基因表达的环状结构域和具有高分位数新生RNA水平的环状结构域。作者发现，在这两种情况下，insulation都明显减弱(Fig. 2N)。综上所述，这些数据表明，RNAPII与染色质折叠的重建有关，并且它的耗尽会影响loop的形成。
考虑到拓扑异构酶（TOP2A/B）对RNAPII动态的局限影响，研究者想确定G1-reentry细胞中TOP2缺失是否可以解释RNAPII缺失所产生的影响，因而应用携带/未完全敲除TOP2B基因并纯合表达mAID-tagged TOP2A的大肠癌细胞系HCT116。先验证了生长素对TOP2A/B的降解作用，联合FACS得到G1-reentry细胞，并分析新生RNA水平以及所有层级染色质结构的变化。多种数据分析表明RNAPII降解对染色质重折叠造成的影响无法由TOP2A/B降解概括，而是以聚合酶为中心。
耗尽RNAPII的G1-reentry细胞的HI-C数据显示A/Bcompartment混合、TAD侵蚀和loop的差别损失/增益。作者继续研究了生长素处理后reentry细胞中CTCF/粘附素亚基水平的变化。Western blotting显示染色质上的CTCF、SMC1A或Rad21水平波动很小，这在免疫荧光定量中得到了证实(Fig. 3, A和B)。为了了解作者的发现是否是由于NIPBL和CTCF核分布的变化，作者对这些因素进行了超分辨定位。双色dSTORM在对照组和生长素处理的G1-reentry细胞中产生了以下观察结果。首先，当RNAPII耗尽时，NIPBL定位在较小的簇中。同时，作者在扩展和变形的簇中也观察到了更多的局域化现象(Fig. 3C)。其次，CTCF簇的平均大小没有改变，但在对照细胞中，50%的CTCF簇位于<129px2，而在生长素处理的细胞中，50%位于<82px2(Fig. 3C)。这些结果，以及染色质上NIPBL/MAU2/WAPL水平的变化，暗示在没有RNAPII的情况下，异常的粘附素(很可能)加载到染色质上，并预测最终在CTCF结合位点的粘附素将会减少。为了验证这一预测，作者在对照和生长素处理的reentry细胞中生成了SMC1A和Rad21 Cut&Tag数据，发现全基因组CTCF位点的粘附素信号显著减少(Fig. 3D)。作者发现，CTCF位点读数的减少伴随着生长素处理的reentry细胞中映射到非活性TSSs的信号增加20%到30%，以及广泛存在的基因间信号增加>11%(Fig. 3E)。因此，CTCF位点粘附素占有率的普遍减少会损害全基因组的loop形成(Fig. 3E)。值得注意的是，尽管通过ATAC-seq(测序分析)判断出CTCF近端可及性没有减少，这些变化还是发生了(Fig. 3F)。RNAP耗尽的TSSs中的ATAC-SEQ信号显著增加(Fig. 3G)，染色质上的TBP(TATA盒结合蛋白)水平也是如此(Fig. 3A)。
为了剖析RNAPII和粘附素重新装载到染色质之间的联系，作者转向染色质折叠的电子模拟。假设大多数粘附素(90%)发生在RNAPII占据的TSSs处(随机加载10%)，作者模拟了对照染色质折叠。经过多次迭代，作者的模型生成了一个类似于Hi-C数据的平均关联地图(Fig. 4, A和B)。作者观察到了：loop的形成明显被削弱(Fig. 4, C和D)，但更大的loop大小与作者的实验结果相符(Figs. 2, K 、L和 3E)。因此，作者的模型表明，不能通过RNAPII结合位点加载粘附素，这足以解释实验观察到的主要染色质折叠差异。为了直接研究RNAPII和粘附素之间的相互作用，作者设计了一维模拟。作者观察到oop的形成和错综复杂的区域划分 (Fig. 4E)。RNAP的耗尽消除了区域化现象，loop频率再次明显降低。loop再次变大的同时，粘附素占有率降低。建模表明实验中的主要染色质折叠差异可以通过RNAPII结合位点无法加载黏连素来解释，并且推断出实验中观察到的效果可以通过RNAP占据位点的黏连素与转录活性和loop挤压之间的相互作用之间的简单关系来说明。
全文小结：
作者发现了环挤出对RNAPII的依赖性，RNAPII在退出有丝分裂后主导着基因组重组。这种依赖性可能说明了有丝分裂的重要性，因为TF与有丝分裂染色质的关联可以决定RNAP的定位、粘附素的加载和环的挤出。然而，聚合酶、TF和粘附素亚基在这一转变过程中的确切相互作用仍有待进一步阐明。
参考文献：
Zhang S, Ubelmesser N, Josipovic N, et al. RNA polymerase II is required for spatial chromatin reorganization following exit from mitosis. Sci Adv 2021; 7(43): eabg8205.
