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唾液也可以检测疾病？临床试验的又一新思路
作者：刘 一 一
唾液检测是一种近年兴起的、研究比较热门的医学检查方法。唾液作为人体重要的排泄途径之一，是由血液中的水、盐和大量分子与口腔中的唾液蛋白等混合而成。血液中的许多成分通过胞内或胞外途径进入唾液，使得血液中可以检测的大多数化合物也存在于唾液中，因此，从这个意义上来说，唾液相较于尿液、血液、粪便、脑脊液等来说，其作为一种安全创伤、取材便捷、无血源性疾病传播的危险、无痛苦和易于接受的生物液体，蕴含着大量的生物信息，能够了解机体的健康与疾病状态。近年来，学者们的研究已经发现，使用唾液样本可以检测除口腔疾病和唾液腺疾病之外的其他系统性疾病，包括糖尿病、心血管疾病、感染性疾病、神经退行性疾病和肿瘤等。
因此，今天将和大家分享的是一篇发表在《Movement Disorders》上的“Salivary microR-153 and microR-223 Levels as Potential Diagnostic Biomarkers of Idiopathic Parkinson’s Disease”文章，2021年实时影响因子为10.338。通过学习完本篇文章，希望各位读者能够参考借鉴本篇文章，以发掘临床试验的新思路。
在我国，帕金森病(Parkinson's disease, PD)的患者数量已超过300万，位居世界第一，帕金森及相关的神经退行性疾病已成为继肿瘤、心脑血管病之后中老年人的“第三杀手”。世界卫生组织专家预测，2030年的中国帕金森病患者将达到500万，如此庞大的患者数量，无疑给社会和国家医疗带来了巨大的负担。PD起病缓慢且隐匿，往往是大脑中与疾病相关的病理改变已经出现，但常规影像学检查却无明显表现。当患者被确诊时，病情大多已经是中晚期，这导致绝大多数 PD 患者错失了早期治疗的最佳时机。既往的研究已经发现，在过去的25年里，PD诊断的准确性仅为80%，尤其是早期PD (Hoehn和Yahr[H&Y]阶段1)特别容易误诊，因此，能够早期诊断PD对疾病的治疗和预后都影响重大。
唾液具有无创获取、方便取用、成本廉价等多种优势，并能最大限度地减少类似于采集脑脊液、血液等时给患者带来的紧张、害怕等情绪压力，非常适合辅助神经系统疾病的早期诊断，尤其适用于多次采样以评估治疗效果。但唾液检测也存在一个很大的劣势，即尚缺乏特异性的、标准化的方法。
作者通过收集83名PD患者和77名无神经系统疾病的实验对照组，采集唾液并提取RNA，采用RT-PCR方法检测miR-153和miR-223水平，以探索唾液中存在的miRNA将有可能成为PD的主要生物标记物并应用于临床。
第一步，确定待检测生物标志物。作者通过TargetScan数据库预测α突出核蛋白（α-synuclein）的调控miRNA，并综合前期的研究分析，确定了本实验的待检测miRNA，即miR-153和miR-223。
Tips：
1） miRNA靶基因预测数据库。 TargetScan是一款预测miRNA结合位点的软件，对于哺乳动物中miRNA结合位点预测的效果非常好。除了TargetScan数据库以外，miRNA靶基因预测数据库还有MiRWalk，miRMAp，miRBase、miRDB等等，想要了解更多上述数据库的信息，可以关注生信人的公众号哦，在上面可以找到更详细的功能介绍。
2）待检测生物标志物的选择。非编码RNA近年来一直是各学者们的研究热点，本篇文章选用的是miRNA，但非编码RNA是一个很庞大的家族，还包括cirRNA、lncRNA等，读者们后期可变换一下待预测分子的选择，如阿尔兹海默症的β淀粉样蛋白Aβ、tau蛋白等，通过数据库预测靶向调控的非编码RNA，参照本课题的套路就又可以复刻出很多篇临床试验文章了呢。关于circRNA靶基因预测数据库（Circular RNA Interactome），lncRNA靶基因预测数据库（LncRNA2 target，Starbase等），更详细的数据库介绍同样可以在本公众号中找到哦。
第二步，唾液采集和处理。 由于目前唾液检测尚缺乏特异性的、标准化的方法，唾液取材也是一个比较大的挑战。本文的唾液采集和处理方法如下，读者们可以参考。采集时间：进食食物或液体后至少间隔30分钟。采集方法：被动流口水法。处理：4℃条件下最多保存3h。随后在4℃，10,000rpm条件下，离心20min以去除食物颗粒，降低样品粘度，后提取上清液保存在-80℃条件下。
Tips：
1） 唾液稳定性。在本篇文章中，作者已经明确了唾液在实验条件下存放具有很高的稳定性，并不会影响样本，作者探讨了其在长达4年的储存时间下，也不会对唾液产生显著影响（P = 0.3）。 也正是其具备很高的稳定性，其作为疾病生物标志物的研究潜力就显得更大了。
2）样本采集时唾液含量可能受昼夜节律和时间的影响。唾液虽然易于获取，但唾液的分泌受口腔状况、昼夜节律和时间的影响，导致分泌量和组分发生改变，所以为了最大可能的减少样本间的差异，建议读者们后续实验采集的时候注意固定采集时间。
3）采集病人的依从性。帕金森病常会表现出唾液分泌过多或口干等症状，这两种临床症状都可能阻碍唾液的收集，而导致唾液出现不同的稠度和浓度。为了消除唾液分泌的影响，我们在进行唾液中参数评估时，应该将参数标记为标准化后的总蛋白含量或唾液流速。
第三步，分析其他参数对实验结果的影响。在临床试验收集时，我们一般也会纳入年龄、性别、药物接触、疾病持续时间以及同时罹患其他疾病等参数，此时可采用单因素Cox回归分析、多因素Cox回归分析等统计学方法，计算风险系数，以评估这些参数对实验结果的影响。
Tips：
1）药物影响。很多时候，我们选取入选病人的时候，他们难免会需要长期服用一些治疗药物，而这些药物有时会对实验产生影响，此时如果为了排除药物影响而人为的让患者停药就显得不那么实际了。在本篇文章中，作者的研究对象关注在帕金森病的人群中，帕金森病病人会服用多巴胺类药物，其通过外源性地补充黑质纹状体的多巴胺来治疗疾病。作者通过将药物与待检测标志物进行相关性分析，如下图，结果显示两者之间的相关性无统计学差异，可排除药物的对参数的干扰。
综上，本篇论文有很多值得我们借鉴学习的地方，后期读者们在开展临床试验的时候可以参考。但本研究也有几个局限性：
1）本实验为单中心临床研究，实验结果会有一定的地域偏差，后期读者们可以开展多中心临床研究，会更有参考价值。
2）本篇文章样本量相对较少，增加样本量可以增加结果可行度。
3）PD的临床表现包括运动症状，即运动过缓、肌强直、静止性震颤和姿势步态异常。除运动症状外，帕金森病患者同时伴随多种非运动症状，比如情绪异常（抑郁或冷漠）、睡眠障碍、快速眼动行为障碍（RBD），感觉障碍（如嗅觉减退）、自主神经系统疾病（如直立性低血压、泌尿生殖系统功能障碍、便秘和多汗症）和认知障碍等。其中一些非运动症状，包括RBD、便秘、贫血等，可能出现在运动症状几年或几十年前出现，可称为“前驱”或“前运动”阶段的疾病，可利于疾病的早期诊断。本实验虽然探讨了PD疾病分期对和待测量生物标志物的相互影响，但未区分PD不同临床症状对检测分子的影响，后续读者们在设计临床试验的时候可以加入症状区分，以增加检测分子的临床症状的特异性。
尽管目前关于唾液分析对PD的诊断价值的实验研究已经取得了一定的进展，但尚缺乏PD诊断的灵敏度、特异性及研究的可重复性，后期研究者们需要开展更多的实验研究进行进一步的探讨。同时，制定出规范化的唾液的采样、储存、处理、加工和分析技术也十分重要。所以，研究者们有必要尽早建立起唾液样本库，并进一步完善唾液的采集、贮存、成分分离和检测技术，使之标准化。在次，我们希望未来能有更多的实验室关注唾液对于疾病诊断的课题研究，并对其进一步研究验证，使得如此“价廉物美”的唾液样本，能成为一个很好的诊断工具。
文章的最后，再给大家推荐一个利用唾液检测疾病以开展出更多的临床试验的小妙招。
Tips：
唾液数据库。本文前面已经给各位读者们推荐了，可以通过目前所研究的疾病中已存在的蛋白生物标志物，通过公共数据库去预测其靶向调控的非编码RNA，并进行检测。此外，读者们还可以利用另一个宝贵的数据库，即目前唯一一个致力于唾液组学研究的网站，Salivaomics Knowledge Base (SKB) （http://www.skb.edu）。唾液中含有丰富DNA、RNA、蛋白质、细胞因子，以及大量微生物和其代谢产物等，SKB网站上则存储了大量人类唾液生物学、蛋白质组学、基因组学等方面的信息。读者们后续可以在该网站上系统性地搜集唾液组学相关的数据资料，确定疾病的研究分子。
参考文献：
Pawlik P, Błochowiak K. The Role of Salivary Biomarkers in the Early Diagnosis of Alzheimer's Disease and Parkinson's Disease. Diagnostics (Basel). 2021;11(2):371. Published 2021 Feb 22.
Cressatti M, Juwara L, Galindez JM, Velly AM, Nkurunziza ES, Marier S, Canie O, Gornistky M, Schipper HM. Salivary microR-153 and microR-223 Levels as Potential Diagnostic Biomarkers of Idiopathic Parkinson's Disease. Mov Disord. 2020 Mar;35(3):468-477.
