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小编最近在NATURE COMMUNICATIONS（最近一年的影响因子为：14.919。比上一年增加了2.798)）这篇杂志上看到一篇单细胞测序的文章，《Single-cell analysis of diverse immune phenotypes in malignant pleural effusion》。最近的单细胞测序的狂热自不必多说，但是除了单细胞测序这个热点外，小编的第一反应是，这个样本极容易获得。值得我们学习。
背景知识：
不同免疫细胞之间复杂的相互作用在恶性胸腔积液的发生发展中起着重要作用。在这里，作者对非小细胞肺癌诱发的MPE患者的62,382个细胞进行单细胞RNA测序，以描述MPE中浸润的免疫细胞的组成、谱系和功能状态。与血液中相应的免疫细胞相比，MPE中的免疫细胞表现出大量富含调节性T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞的转录特征。
malignant pleural effusion (MPE)：恶性胸腔积液
结果解读：
为了研究mpE环境的免疫学特征，作者采用基于液滴的ScRNA-seq技术研究了MPE和血液中免疫细胞的转录谱(Fig.1a)。在对读取深度和线粒体读取计数进行基因表达归一化的定性筛选后，仍有62,382个细胞可检测到200-6,000个基因，以供后续分析。其中，33,089个细胞和29,293个细胞分别来自MPE和血液(Fig.1b)。通过分级聚类将19个表达组分组，从而确定了T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和髓样细胞的主要细胞室的特征，其中最丰富的MPE免疫细胞是T细胞(Fig.1c–e)。对于MPE和血液中各细胞类型的差异表达基因，作者采用基因集富集分析，确定与MPE相关的途径。作者发现，MPE的糖酵解途径以及细胞增殖和免疫反应信号明显较高(Fig.1f)。在免疫细胞类型中，T细胞在MPE中显著富集，而NK细胞在血液中显著富集(Fig.1g)。
根据细胞谱系和功能状态，T细胞亚群被鉴定为CD4+T细胞(初始CD4+T细胞、Th1/17细胞、T滤泡辅助细胞[Tfh]细胞和Treg细胞)；CD8+T细胞(初始T细胞、细胞毒性T细胞和耗尽T细胞)；增殖的T细胞，既有CD4+T细胞，也有CD8+T细胞(Fig.2a, b)。与先前在NSCLC中的发现一致，作者还发现MPE中细胞毒性T细胞的耗竭和Treg细胞的出现(Fig.2c)。
为了了解T细胞亚型之间的状态转换，作者使用Destiny绘制扩散图，以数据为基础构建T细胞亚型的潜在发育轨迹。从表达数据或标记基因推断的发育轨迹表明，初始T细胞最终通过CD8+T细胞中的细胞毒性T细胞进入耗竭状态(Fig.2d)。在CD4+T细胞中，初始T细胞位于与Tfh细胞和Treg细胞相对的一端，Th1/17细胞主要位于中心(Fig.2e)。 PDCD1是一个重要的免疫检查点靶点，在Tfh中高表达，提示Tfh细胞也可能是PD1抑制剂在MPE中的效应细胞之一。79.7%的CD4+T细胞表达αβT细胞受体，其中CD8+T细胞的表达率为78.5%。在CD8+T细胞中，细胞毒性T细胞和耗尽的T细胞之间存在显著的共享TCR (Fig.2f)。在每个样本中都发现了这些共享的TCR，这表明T细胞增殖是MPE的常见现象，而不是某些癌症患者的特征。作者将这些与细胞毒T细胞共同表达TCR的耗竭T细胞标记为耗竭c1簇，将未扩增的耗竭T细胞标记为c2。此外，作者还表明，与CD4+T细胞中的耗竭簇Tfh特征相结合，能够区分高耗竭-C1特征的患者的预后(Fig.2g)。
根据典型B细胞标志物的表达和分布，作者鉴定了7个CD19+B细胞亚群和4个浆细胞亚群。血浆B细胞表达免疫球蛋白γ(IGHG)和XBP1(Fig.3a–c)。为了进一步研究B细胞的差异转录变化，作者比较了MPE中Breg细胞和幼稚B细胞的表达谱。作者分别比较了MPE和血液中幼稚B细胞和Breg的差异基因。作者得出的结论是，MPE中幼稚B细胞和Bregs基因表达的最高水平上调具有相似的富集模式。与血液中的相应细胞相比，MPE中的幼稚B细胞和Breg细胞表达更多的糖代谢信号(PKM、TPI1、ENO1和LDHA)、缺氧反应(NR4A2、CXCR4和HIF1A)和细胞增殖信号(H3F3B、MIF和ZFP36L2)。TNFRSF13B、ITGB1和LGALS1基因在Breg细胞中均显著高表达(Fig.3d)，提示Breg细胞具有通过细胞间相互作用调节T细胞等其他重要免疫细胞的功能。为了探索Breg细胞和T细胞之间的相互作用，作者研究了特定的配体-受体是否参加Breg细胞和效应T细胞亚群之间的相互作用。作者的数据显示，在MPE中，Breg细胞和CD8+T细胞之间的预测相互作用的数量显著减少。Breg细胞的细胞间通讯以CD4+T细胞为主，包括Th1/17、Treg和Tfh(Fig.3e)。
作者检测了髓系细胞的典型标记基因，并在MPE和血液中鉴定出簇。标记基因CD14、FCGR3A和CD68的高表达定义了7个单核/巨噬细胞簇。CD1C、CLEC10A和FCGR1A的高表达标志着两个树突状细胞(DC)簇(Fig.4a–c)。作者检查了巨噬细胞群中M1和M2状态的标记基因的表达水平，发现MPE巨噬细胞高表达M2标记基因(Fig.4d)。这表明M1/M2分类与基于基因表达的单核/巨噬细胞亚类无明显关系。与单核细胞相比，巨噬细胞的免疫应答、抗原提呈和糖酵解途径活性显著增强(Fig.4e)。DC有两个亚群：MPE中富含DC-C7，并具有较高水平的免疫激活基因MIF、ALOX5、CKLF和CD1s (Fig.4f)。作者分析了MPE中巨噬细胞和单核细胞的轨迹，发现这些细胞有各自的轨迹状态，表明肿瘤浸润性巨噬细胞不同于单核细胞(Fig.4g)。
与血液相比，MPE中Tfh和巨噬细胞中代谢途径的表达增加最多(Fig.5a)。几乎所有的MPE细胞类型都上调了糖酵解相关代谢基因的表达；这些免疫细胞亚型的这种普遍的代谢特征与胸腔积液中的缺氧环境是一致的(Fig.5b)。在利用MPE中高表达基因绘制的糖酵解代谢路径图中，作者发现了一些限速基因，如ashk、pfk和pk，从而进一步证实了MPE中Tfh细胞的糖酵解代谢被激活(Fig.5c)。此外，戊糖磷酸途径明显下调，而OXPHOS和脂肪酸氧化略有上调，这与MPE巨噬细胞M2极化表型一致(Fig.5b)。 综上所述，免疫细胞的这些代谢表型可能有助于建立它们与其他细胞相互作用和调节肿瘤微环境的功能。
此前，全基因组关联研究(GWAS)已经在中国人群中确定了54个与非小细胞肺癌易感性相关的基因。作者在MPE中通过已经确定的簇进一步分析了这些基因，发现了预期的和令人惊讶的簇特定的表达模式(Fig.6)。BPTF在NK细胞和T细胞中高表达，抑制NK细胞活性，降低T细胞介导的抗肿瘤免疫。作者的结果还表明，肿瘤患者免疫细胞中易感基因的表达发生了变化，提示这些单核苷酸多态性和易感基因可能通过调节免疫细胞的功能而影响肿瘤的发生发展。
接下来，作者评估了特定免疫细胞类型对MPE形成的作用。在胸腔中，淋巴细胞通过重要的信号分子，如趋化因子、细胞因子和生长因子，控制血管活性事件的发生和MPE的发展。与低表达的患者相比，高表达趋化因子信号的患者的总体存活率明显较低(Fig.7)。尽管对这些重要信号通路在MPE形成过程中的分子机制进行了研究，但它们与MPE诊断和治疗的关系仍存在争议。作者的研究结果支持趋化因子信号的细胞特异性表达与预后之间的关系。
全文小结：
在本研究中，作者在单细胞水平上对人MPE中的免疫细胞进行了详细的分子描述，绘制了MPE和血液中免疫细胞的频率和分子状态的差异。具体地说，作者注意到MPE中Treg细胞、B细胞和巨噬细胞数量的增加，并显示了对MPE重要的转录细胞状态，主要包括Tfh细胞和Breg细胞。此外，作者在MPE环境中发现了Breg细胞与CD4+T细胞的特异性细胞间通讯，并且发现糖酵解途径在MPE免疫细胞中普遍上调。总之，这项研究提供了来自复杂MPE微环境的免疫细胞的全局图像，并描绘了免疫细胞不同于血液免疫细胞的转录特征活动。作者的数据可以作为后续深入研究的资源，以完成更深层次的生物学探索，并为晚期非小细胞肺癌的免疫治疗提供治疗靶点和生物标志物。
